戎宏立 ，王长彪 ，李 倩 ，孟玉平 ，曹秋芬 ，3

（1.山西大学生物工程学院，山西太原030006；2.山西省农业科学院生物技术研究中心，山西太原030031；3.农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，山西太原030031）

核糖体蛋白质（RP）是一种广泛存在的RNA结合蛋白，它与核糖体RNA共同组成了核糖体。目前，已发现的核糖体蛋白有80多种。以往认为，RP的功能仅仅是与核糖体RNA（rRNA）共同参与蛋白质的合成，但近年来随着技术手段的进步和科学研究的深入，发现RP有诸多复杂的核糖体外功能，对于RP功能的探索成为科学领域的一大热点。

目前，研究发现的RP的核糖体外功能主要包括：调控转录和翻译，调控细胞增殖、凋亡、分化，参与胚胎发育，参与癌症发生等[1-5]。曹秋芬等[6-10]已经成功构建了枣结果枝的cDNA文库，并对水通道蛋白、金属硫蛋白、抗坏血酸过氧化物酶等一些有研究价值的基因，进行了表达载体的构建、体外胁迫表达等一系列的研究分析。但是关于枣树核糖体蛋白基因的分析目前尚处于空白阶段。

本研究利用生物信息学手段对枣树的核糖体蛋白基因进行相关分析，对进一步认识枣树的生物合成过程，查找其与其他物种的差异性，进而发掘枣树的优良基因具有十分重要的理论指导意义。

1 材料和方法

1.1 材料

枣树结果枝ESTs序列来源于山西省农科院生物技术研究中心曹秋芬课题组构建的壶瓶枣（Ziziphusjujuba Millhupingzao）结果枝cDNA文库。

1.2 方法

1.2.1 ESTs功能注释 利用Blast2GO软件对测序后的EST进行功能注释[11-12]。分析所用参数为:

BLAST：

Blast DB:nr；Number of Blast Hits:20；Blast Expect value:1e-25；Blast Program:blastx；Blast Mode:QBlast-NCBI；HSPLength cutoff:33.

Annotation configuration：

Pre-eValue-Hit-Filter:1e-25；Pre-Smiliarity-Hit-Filter:15；Annotation CutOff:55；GOWeight:5.

1.2.2 核糖体蛋白基因的分析[13-18]从经过功能注释的ESTs序列中筛选出核糖体蛋白基因，用Clustal x1.83进行比对去除冗余序列，通过Blastx搜索NCBI的核苷酸数据库，序列相似性分析获得具有完整ORF的枣核糖体蛋白基因；利用DNAStar软件中的EditSeq程序分析枣树核糖体蛋白基因的核苷酸、氨基酸序列的组成及理化性质、查找开放阅读框（ Open Reading Frame，ORF）并进行翻译；利用SOPMA在线工具完成蛋白质二级结构的预测；利用在线软件ProtScale Server和NetPhos 2.0 Server分别对枣核糖体蛋白基因的氨基酸序列疏水性/亲水性及潜在磷酸化位点进行预测分析；利用PSORT对枣树核糖体蛋白质进行亚细胞定位；利用DNAStar软件中的MegAlign程序通过氨基酸比对构建系统进化树，参数为默认。

2 结果与分析

2.1 ESTs功能注释

通过筛选枣生长初期结果枝的cDNA文库，选取长度500 bp以上的625个ESTs序列进行测序，得到522个有用序列，其中，397个ESTs序列与NCBI中已知功能基因相似性较高，占76.1%；有125个ESTs是NCBI中没有的未知序列，占23.9%。对397个已知功能的ESTs序列进行分类整理，发现有42个基因含有2个以上的ESTs，重复表达的ESTs共77个，表达量最多的是40S核糖体蛋白，S27有6个ESTs，其次富含脯氨酸蛋白有5个ESTs，类萌蛋白有4个ESTs。本研究还发现，522个ESTs中，与抗氧化相关的基因有：超氧化物歧化酶、2-cys过氧化还原酶、过氧化物酶、抗坏血酸过氧化物酶；与抗逆相关的基因有：玉米黄质环氧化酶、shaggy蛋白激酶、亲环蛋白、gast蛋白、铝诱导蛋白、富含脯氨酸蛋白、硫氧还蛋白、热休克蛋白等（表1）。这些有用的枣结果枝抗逆相关基因需要进一步研究分析，以期为枣树的基因研究，品种选育、改良提供有力的试验依据。

表1 枣结果枝抗逆相关基因功能注释

将397条有功能注释的ESTs序列分成生物进程 （Biological Process）、 细胞组分（Cellular Component）和分子功能（Molecular Function）3个类型。从图1可以看出，生物进程中比例最大的是 metabolic process，其次是 cellular process；从图2可以看出，细胞组分中占最大比例的是cell，其次为organelle；从图3可以看出，分子功能中比例最大的是binding，其次是catalytic activity。3个类型的注释结果统计反映出cDNA文库中基础代谢相关的基因、蛋白质合成表达量比较多；而本研究材料为枣生长初期的结果枝，其细胞生长旺盛，蛋白合成转运活跃，二者反映的情况是一致的。

320条ESTs通过KEGG数据库进行代谢分析，得到123条ESTs的62个代谢途径，其中，淀粉和蔗糖代谢途径（Starch and sucrosemetabolism）最多（7条，5.69%），其次是卟啉和叶绿素代谢途径（Porph-yrin and chlorophyll metabolism；6条，4.88%）（ 表2）。

表2 枣结果枝EST代谢途径分析

2.2 核糖体蛋白基因的分析

筛选枣结果枝ESTs，去除冗余的序列，获得24条具有完整ORF的核糖体蛋白ESTs。利用DNAStar软件中的EditSeq程序分析它们的核苷酸、氨基酸序列组成及理化性质，结果表明，24条核糖体蛋白基因中最长为60S核糖体蛋白L5，为912 bp；最短的为60S核糖体蛋白L29-1，为183 bp。而分子量最大的是50S核糖体蛋白L4，分子量为32 764.44，最小的是40S核糖体蛋白S30，分子量为6 931.12。核糖体蛋白多肽大多呈碱性，只有50S核糖体蛋白L12为弱酸性，其PI为5.55。用SOPMA预测枣核糖体蛋白氨基酸序列的二级结构，结果显示，α-螺旋和无规则卷曲是枣核糖体蛋白的主要结构元件，而β-转角和延伸链则散布于整个蛋白质中。

用ProtScale Server对枣核糖体蛋白基因的氨基酸序列疏水性/亲水性进行预测，负值越小表示亲水性越强，正值越大表示疏水性越强，介于－0.5～＋0.5之间的为两性氨基酸。分析结果显示，60S核糖体蛋白L29-1（图4）多肽链整条都处于亲水区域，其中，第36位的天冬氨酸（Asp）具有最高分值-0.611，第51位的天冬酰胺（Asn）亲水性最强，具有最低分值-3.667；40S核糖体蛋白 S25（ 图 5）、60S核糖体蛋白 L13-1（ 图6）在N端具有一个明显的亲水区域；40S核糖体蛋白S30（图7）多肽链中间有一个明显的亲水区域；其余的核糖体蛋白多肽链没有明显的亲水区域或疏水区域，亲水性氨基酸分布比较均匀，且数量大于疏水性氨基酸，因此，可推断它们属于可溶性蛋白。

利用在线工具NetPhos 2.0 Server分别对24个核糖体蛋白的氨基酸序列进行潜在磷酸化位点分析，依据分值大于0.5的氨基酸位点都是磷酸化位点，结果列于表3。由表3可知，24个序列都具有潜在的磷酸化位点，分别位于Ser，Thr和Tyr这3个氨基酸上，其中，Ser潜在的磷酸化位点数最多。比较24个核糖体蛋白所具有的潜在磷酸化位点总数可知，50S核糖体蛋白L4的磷酸化位点数最高，为19，其次为60S核糖体蛋白L5和50S核糖体蛋白L5，分别为18和16。

表3 枣核糖体蛋白的潜在磷酸化位点

利用DNAStar软件中的MegAlign程序对枣结果枝核糖体蛋白通过氨基酸比对构建系统进化树，结果如图8所示。从图8可以看出，24个基因分为2类，50S核糖体蛋白L6为一类；而其余的核糖体蛋白为一类，包括4个亚类，每一亚类的核糖体蛋白基因可能存在于同一基因上。

利用PSORT对24个核糖体蛋白进行亚细胞定位，结果如表4所示。从表4发现，大部分核糖体蛋白定位于细胞核中。结合表4和图8发现，在某些位于同一进化分枝上的核糖体蛋白具有不同的亚细胞定位结果，说明它们之间可能具有不同的细胞学功能，比如50S核糖体蛋白L12和40S核糖体蛋白S27，50S核糖体蛋白L4和核糖体蛋白S8e位于同一进化分枝上，但它们分别 定位在叶绿体和细胞核中。

表4 枣核糖体蛋白亚细胞定位

3 结果与讨论

本研究通过对枣生长初期结果枝cDNA文库中625个ESTs序列的测序，得到了522个有用序列，在397个与NCBI中已知功能基因相似性较高的EST中，发现了一些可能与枣树抗寒、抗旱、抗逆性强密切相关的基因，比如超氧化物歧化酶，2-cys过氧化还原酶，过氧化物酶，抗坏血酸过氧化物酶，玉米黄质环氧化酶，shaggy蛋白激酶，亲环蛋白，gast蛋白，铝诱导蛋白，富含脯氨酸蛋白，硫氧还蛋白，热休克蛋白等。

进一步对24条核糖体蛋白基因分析表明，核糖体蛋白属于可溶性蛋白，分子量在6 931.12～32 764.44之间，α-螺旋和无规则卷曲是枣核糖体蛋白的主要结构元件，而β-转角和延伸链则散布于整个蛋白质中。在24个核糖体蛋白中，50S核糖体蛋白L4的磷酸化位点数最高，为19。一般来说，多肽链中的氨基酸潜在的磷酸化位点越多，发挥更多功能的可能性就越大。本研究通过比较发现，位于叶绿体中的核糖体蛋白的磷酸化位点数普遍高于细胞质中核糖体蛋白的磷酸化位点数，这可能与数量有限的叶绿体核糖体蛋白要发挥相对更多的功能有关。通过氨基酸比对构建系统进化树发现，同一亚类的核糖体蛋白常常具有不同的亚细胞定位结果，说明它们之间可能具有不同的细胞学功能。

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