屈 岭，顾 蓓，张 宏，石 玥，梁晓春*

(中国医学科学院1.北京协和医学院北京协和医院中医科，北京100730;2.基础医学研究所细胞中心，北京100005)

糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病主要的慢性并发症之一，其发病机制尚未完全阐明。自噬是机体处于物质与能量代谢障碍时由细胞初级溶酶体处理内容性底物的重要生理过程［1］。已有文献报道其在保护胰岛β细胞、改善胰岛素抵抗以及延缓糖尿病慢性并发症发生发展等方面具有重要的作用［2］。有学者发现高浓度葡萄糖可减少INS-1β细胞的自噬［3］。前期研究曾经证实高糖可下调体外原代培养雪旺细胞的增殖活性，并能上调活化的半胱氨酸天冬氨酸酶3(cysteine aspartase-3，caspase-3)的蛋白表达水平和转录水平［4－5］。自噬是否在高糖致体外培养雪旺细胞的损伤中也具有作用呢?为此本研究以永生化的大鼠雪旺细胞(RSC96)作为模型，观察了高浓度葡萄糖对RSC96细胞自噬的影响以及自噬对高糖条件下RSC96细胞增殖活性及凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

RSC96细胞(一种永生化的大鼠雪旺细胞)，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。DMEM培养基(Gibco公司)，胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)、0.05%胰蛋白酶(Hyclone公司)，丙酮酸钠、谷氨酰胺、G-418、MTT、3-MA(Sigma 公司)，兔抗大鼠Beclin1多克隆抗体(Abcam公司)，兔抗大鼠caspase-3多克隆抗体(Santa Cruz公司)，小鼠抗大鼠S-100单克隆抗体(博士德公司)，TRITC标记的山羊抗兔IgG、FITC标记的山羊抗小鼠IgG(北京西雅金桥生物技术有限公司)。

1.2 RSC96细胞培养及培养条件

复苏RSC96细胞，加入DMEM培养基、FBS(终浓度20%)、谷氨酰胺(终浓度2 mmol/L)、丙酮酸钠(终浓度1 mmol/L)、HEPES(终浓度12.5 mmol/L)、PS(终浓度青霉素100 IU/mL、链霉素100 μg/mL)，2～3 d换液1次。正常对照(Con)组为DMEM培养基;高浓度葡萄糖(Glu)为DMEM培养基+葡萄糖(终浓度125 mmol/L)。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)浓度10 mmol/L。

1.3 MTT比色法

取96孔板，弃培养基，加入10%MTT 200 μL/孔于37℃孵育2～4 h后，吸出培养液，加入 DMSO 200 μL/孔，室温静置30 min至1 h于酶标分析仪检测吸光度值(absorbance，A)，检测波长570 nm。重复5孔。

1.4 Western blot

各组细胞标本加入裂解液进行匀浆，离心取上清液，其蛋白浓度用BCA法测定，将含有50 μg蛋白的上清液用SDS-PAGE电泳分离，并转移到硝酸纤维素膜上，用含5%脱脂奶粉的TBS-T中和硝酸纤维素膜降低非特异性结合。一抗孵育，冲洗后再用二抗孵育，采用ECL试剂盒检测。条带用Gel-Pro图像分析系统扫描定量。重复3次。

1.5 免疫荧光检测

制备细胞爬片，PBS冲洗后加入4℃丙酮固定15 min。0.1%Triton-X 100浸泡10 min打孔，加入正常血清封闭液，加入一抗工作液(1∶50稀释)，阴性组对照组以PBS代替一抗，湿盒中4℃过夜，加入二抗工作液(1∶100稀释)，37 ℃孵育20 min，加入 DAPI工作液，避光室温下复染10 min。激发波长364 nm，发射波长488 nm，探测DAPI的蓝色荧光;激发波长488 nm，发射波长525 nm，探测FITC绿色荧光和激发波长547 nm，发射波长620 nm，探测TRITC的红色荧光。扫描速度:慢扫描。CLSM下观察并用Leica Confocal图像分析软件照相。采用Image-Pro Plus 6.0软件测量积分吸光密度(IA)。重复3次。

1.6 统计学分析

数据录入和处理均采用SPSS13.0统计软件包，分析前采用One Sample Kolmoglrov-Smirnov Z test检验数据是否符合正态分布，符合正态分布的数据采用均数±标准差(±s)描述，2组样本采用独立样本t检验，多组独立样本比较采用单因素方差分析，方差齐者采用 Bonferroni法，不齐者采用Tambane'sT2法;非正态分布数据采用非参数检验方法(k个独立样本的检验)。

2 结果

2.1 高浓度葡萄糖下调体外培养雪旺细胞beclin1的表达

24 h Glu组beclin1蛋白表达较Con组显著降低(P＜0.05)。其余各时间点两组之间beclin1蛋白表达无差异(图1A)。RSC96细胞中的beclin1蛋白被标记为红色荧光，细胞质被标记为绿色荧光，细胞核被标记为蓝色荧光。Con组可见红色荧光呈点片状分布，主要集中在细胞核周围区域内。Glu组红色荧光强度较Con组明显减弱(图1B)。半定量分析显示(图1C)，Glu组红色荧光IA值较Con组明显降低(P＜0.05)。

2.2 高浓度葡萄抑制体外培养雪旺细胞的增殖活性

6及24 h时各组A值无明显差异，48 h时Glu组A值较Con组显著减低(P＜0.05)，72 h时与Con组比较Glu组A值减低更加明显(P＜0.01)(图2)。

图1 高浓度葡萄糖对体外培养RSC96细胞beclin1表达的影响Fig 1 The effect of the high concentration of glucose on beclin1 level of RSC96 cells in vitro

2.3 抑制自噬增加高浓度葡萄对外培养雪旺细胞增殖活性的削弱作用

与Con组比较，Glu组、Con+3-MA组及Glu+3-MA组A值均下降(P＜0.01)。与Glu组比较，Con+3-MA与Glu+3-MA组A值均下降(P＜0.01)。Con+3-MA与Glu+3-MA组间A值无明显差异(图3)。

2.4 抑制自噬增加caspase-3的活化

各组间caspase-3酶原的表达无明显差异。与Con组比较，Glu及Con+3-MA组P20亚基表达无明显增多。Glu+3-MA组P20亚基蛋白表达水平则较Con+3-MA组上调(P＜0.05);较Con组和Glu组明显上调(P ＜0.01)(图4A，B)。

3 讨论

在生长因子缺乏等病理状态下，细胞可形成双层膜结构包裹细胞器和细胞质的自噬体，再与溶酶体融合形成自噬溶酶体，以降解其中的底物产生磷脂和蛋白质等物质［1］。借此机体不仅清除了受损的细胞器，而且产生的蛋白质等又可作为原料重新参与代谢，为细胞提供能量，维持其存活。DPN患者神经组织长期处于缺血缺氧、营养物质和神经因子缺乏的状态以及持续存在的氧化应激损伤是自噬现象出现异常的前提和基础。然而，目前有关自噬与DPN关系的研究较少。仅有文献报道在STZ诱导的糖尿病大鼠脊髓背根神经元中自噬现象明显增多，经DPN患者血清体外培养的SH-SY5Y细胞也可见自噬现象，自噬可能在细胞凋亡过程中起到保护作用［6－7］。

本实验发现Glu组beclin1蛋白的表达水平较Con组明显减少。beclin1是目前常用的自噬检测指标之一，其参与自噬体形成的启动过程，表达与自噬的发生正相关［8］。综合免疫组织化学和 Western bolt的检测结果，本研究初步认为高浓度葡萄糖将减少雪旺细胞中的自噬发生。

自噬在糖尿病慢性并发症时具有何种病理生理作用目前尚不清楚，多数学者认为自噬可能具有延缓慢性并发症进展的作用［2］。与既往研究结果一致［4］，本研究也证实高浓度葡萄糖能抑制体外培养的雪旺细胞的增殖活性，并且发现应用3-MA抑制自噬后，加剧了高糖对雪旺细胞增殖活性的抑制作用。本实验室既往曾观察到高浓度葡萄糖能够上调体外培养雪旺细胞中caspase-3表达［5］。那么自噬加剧高浓度葡萄糖对雪旺细胞增殖的抑制作用是否同通过调节凋亡途径的而实现呢?此次研究发现自噬被抑制后，caspase-3的活化亦随之上调。故推测自噬活性降低可能是高浓度葡萄糖增加细胞凋亡的机制之一。

综上所述，根据本实验的研究结果，推测高浓度葡萄糖通过下调自噬活性增加细胞凋亡，而造成细胞的损伤。这可能是DPN发生发展的机制之一。自噬可能是机体抵抗来自内外损伤因素的一种重要途径。糖尿病时可能抑制了正常的自噬活性，从而削弱了机体的自我修复能力，因此造成了包括DPN在内的各种并发症的发生。然而，本研究尚未完全揭示高糖条件下自噬下调的分子机制。今后应进一步阐明高糖减少自噬的信号传导途径以及探讨自噬对细胞凋亡影响的具体作用靶点。尽管如此，通过自噬防御途径使机体减轻高糖、氧化应激损伤等带来损害，从而减少慢性并发症的发生和进展，可能会为DPN的预防和治疗提供崭新的思路。

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