甄永占，赵毓芳，骆广玲，章广玲，刘学军，李 冉，阚 泉

(1.河北联合大学基础医学院组织学与胚胎学教研室;2.河北唐山开滦医疗集团林西医院妇产科;3.河北联合大学附属医院胸外科，河北唐山063000)

多发性骨髓瘤是血液系统发病居第2位的常见恶性肿瘤，对化疗存在普遍抵抗性，目前还是一种难以治愈的致死性疾病。标准的化疗方案仅能使40%～60%患者获得暂时缓解，中位生存期一般不超过3年。大剂量化疗联合造血干细胞移植可使缓解率明显提高，除了极少数病例，最终难免复发［1］。正因为如此，人们对寻找新的抗多发性骨髓瘤药寄予厚望，以进一步提高多发性骨髓瘤患者的生存率和治愈率。力达霉素(lidamycin，LDM)是大分子肽类抗肿瘤抗生素，大量研究表明，LDM具有较强的抗肿瘤活性［2－4］，目前正在国内进行临床Ⅱ期试验研究。本实验研究了力达霉素体内、体外抗鼠骨髓瘤作用，为今后力达霉素在多发性骨髓治疗中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

鼠骨髓瘤细胞SP2/0由本室传代保存。用含10%胎牛血清(Hyclone)的高糖DMEM培养液(Gibco公司)，于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，2 d传代1次，实验用细胞为对数生长期细胞。力达霉素由中国医学科学院医药生物技术研究所甄永苏院士惠赠。蛋白定量试剂盒(BCATMprotein assay kit)(Pierce产品);宽范围蛋白预染Marker(New England Biolabs公司);蛋白质印迹发光液和PVDF膜(Millipore公司);碘化丙啶(propidium iodide，PI)细胞周期检测检测试剂盒(北京宝赛生物技术有限公司);NF-κB抗体(sc-8008)、BCL-2抗体(sc-492)、Survivin抗体(sc-8807)、P27抗体(sc-1641)和Actin抗体(sc-1616)(Santa Cruz公司);HRP标记的羊抗兔、兔抗羊和羊抗小鼠IgG抗体(北京中杉金桥有限责任公司)。BALB/c小鼠，SPF级，雌性，6～8周龄，体质量18～22 g(中国医学科学院实验动物中心)，合格证号:SCXK(京)2007-0001。

1.2 方法

1.2.1 细胞增殖活性检测:MTS法测定细胞存活率，MTS［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，inner salt］是MTT的一种新型类似物，化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2-磺)-5-(3-羧甲基氧苯基)-2-(4-磺苯基)-2氢四唑内盐，简称MTS。原理是MTS在PMS(phenazine methosulfate)存在的情况下可被活细胞内的脱氢酶类还原，转化成液态可溶的产物，而死细胞无此功能，该水溶物可用酶标仪在波长490 nm处检测，测定在490 nm波长处的吸光度值，该值可间接反应活细胞的数量和活性。取对数生长期的细胞，轻轻吹打分散成细胞悬液，记数后以细胞数1×104/孔接种细胞于96孔细胞培养板中，2 h后加入不同浓度的药物处理48 h，每组至少3个平行孔。每孔加入20 μL MTS和PMS混合液(按说明书配制:每2 mL MTS溶液中加入100 μL PMS，现用现配)，37℃继续培养1～4 h，用酶标仪(Thermo Labsystems，Multiskan MK3)于490 nm处测定每个孔的吸光度(A490)值。实验设无药对照孔和无细胞对照孔各3孔，按下面公式计算细胞的存活率:细胞存活率=(加药组A490值－空白组A490值)/(对照组A490值－空白组A490值)×100%。实验重复3次。

1.2.2 流式细胞仪检测细胞周期分布和细胞凋亡:细胞经药物处理后，收集细胞，加入冰冷的磷酸盐缓冲液(PBS)缓冲液将细胞轻轻吹打成单个细胞，离心，PBS洗2遍，用约500 μL的PBS重悬细胞，一边振荡一边加入5 mL预冷的70% 乙醇，4℃固定过夜(如不及时测定，可放－20℃保存两周)。染色前细胞用PBS洗2遍，沉淀重悬于PI染液中(50 mg/L PI+200 mg/L RNase A)，37℃避光染色30 min。细胞经200目尼龙网过滤后，用流式细胞仪测定DNA含量并分析细胞周期变化和细胞凋亡。

1.2.3 Western blot分析:收集 0.1、0.5、1 和2 nmol/L的LDM作用48 h及未加药处理的SP2/0细胞，用预冷的PBS洗3遍，加入新鲜配制的细胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5;1%NP-40;150 mmol/LNaCl;1 mmol/L Na3VO4;1 mmol/L NaF，临用时加入3种蛋白酶抑制剂1%抑蛋白酶肽;10 g/L亮抑酶肽;1 mmol/L苯甲基磺酰氟)100 μL，细胞与裂解液充分混合，冰浴20 min。于4℃，13 000 r/min离心15 min，收集上清液于新的微量离心管中，按照BCA法测定蛋白含量。取各样品等量总蛋白30 μg加入0.25倍体积的5×上样缓冲液，煮沸变性5 min后，在10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)胶上进行电泳。然后转移到硝酸纤维素膜上，1%牛血清白蛋白封闭1 h，一抗4℃孵育过夜后，加相应二抗孵育2 h，膜上滴加化学发光增强剂(Santa Cruz biotechnology SC-2048)，按照试剂说明进行操作，通过凝胶成像系统拍照保存结果。

1.2.4 鼠骨髓瘤细胞系SP2/0移植成瘤的实验治疗:小鼠随机分为4组，每组6只。将对数生长期鼠骨髓瘤SP2/0细胞用0.9%氯化钠注射液制成细胞悬液，给每只小鼠右侧腋窝皮下接种肿瘤细胞数量为(1×106)。在细胞接种后1和8 d尾静脉注射给药2次，LDM按照0.1、0.05和0.025 mg/kg剂量。对照组给予同体积的0.9%氯化钠注射液。每隔2～3 d测量瘤块的长径和短径，计算肿瘤的体积，并记录动物体质量。实验第14天处死动物，剥离各组动物的瘤块，直观地比较肿瘤大小，并称重计算抑瘤率。抑瘤率=(对照组瘤重－实验组瘤重)/对照组瘤重×100%。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 LDM对SP2/0细胞的生长抑制作用

LDM呈浓度依赖性抑制SP2/0细胞增殖，48 h时 IC50为0.56 nmol/L(图1)。

图1 LDM对SP2/0细胞增殖的影响Fig 1 Growth inhibition of SP2/0 cells by LDM(±s，n=3)

2.2 LDM对SP2/0细胞周期分布和细胞凋亡的影响

0.1、0.5、1和2 nmol/L的LDM 作用SP2/0细胞48 h均能诱导G2/M期阻滞，0.5 nmol/L的LDM诱导的G2/M期阻滞最明显，随着剂量的增大(1和2 nmol/L)，凋亡相关的亚G1峰比例显著增加，因此诱导的G2/M期阻滞作用反不如0.5 nmol/L的LDM明显(图2)。

图2 LDM对SP2/0细胞周期分布和细胞凋亡的影响Fig 2 Cell cycle distribution and apoptosis of SP2/0 cells after treatment with LDM

随着LDM浓度的升高，Sub-G1期细胞的数量也增加。1和2 nmol/L LDM可分别引起16.03%和39.87%的SP2/0细胞产生Sub-G1峰(图3)。

2.3 LDM对SP2/0细胞凋亡和周期相关蛋白的影响

LDM作用SP2/0细胞48 h后，LDM浓度依赖性增加SP2/0细胞poly ADP-ribose polymerase(PARP)的切割片断蛋白表达，浓度依赖性地降低SP2/0细胞NF-κB、BCL-2和Survivin的表达，浓度依赖性地上调BAX和P27蛋白的表达(图4)。

2.4 小鼠骨髓瘤细胞移植成瘤模型观察力达霉素在体内的抑瘤作用

图3 流式细胞仪检测LDM对SP2/0细胞凋亡的影响Fig 3 Induction of cell apoptosis by LDM in SP2/0 cells

LDM对SP2/0细胞移植瘤显著抑制生长，呈剂量依赖性，实验第14天处死动物，剥离各组动物的瘤块拍照，直观地比较肿瘤大小，可以看到LDM组的肿瘤明显小于对照组，而且0.1 mg/kg剂量LDM组中有两只没有形成瘤块。称重计算抑瘤率(图5，表1)，0.1、0.05和0.025 mg/kg剂量LDM 组的抑瘤率分别为97.3%、86.3%和35.7%。接种后第10天LDM 0.1 mg/kg剂量组，有一只死亡，表明动物对LDM的耐受剂量为0.05 mg/kg以下。

在实验期间，各组动物的体质量无明显变化。实验结束时，LDM治疗组的动物体质量与对照组相比，没有显著性差异(表1)。

3 讨论

尽管对多发性骨髓瘤的生物学研究取得了长足进展，并采用了大剂量化疗的治疗方案，对于绝大多数患者来说仍然是一种难以治愈的致死性疾病。鉴于此，人们对寻找新的抗癌药寄予厚望，以进一步提高多发性骨髓瘤患者的生存率和治愈率。

表1 LDM对小鼠骨髓瘤SP2/0细胞移植瘤的生长抑制作用Table 1 Inhibitory effects of LDM on the growth of mouse myeloma SP2/0 in BALB/c mice

图4 LDM对SP2/0细胞凋亡和周期相关蛋白表达的影响Fig 4 The expression of proteins associated with apoptosis and cell cycle in SP2/0 cells by Western blot analysis(n=3)

图5 LDM对小鼠骨髓瘤SP2/0细胞移植瘤的生长抑制作用Fig 5 The picture was taken on day 14 after cell implantation

LDM是由一个含110个氨基酸的酸性辅基蛋白和一个含烯二炔结构的发色团通过非共价键结合而成的化合物，其中发色团是LDM的主要活性部分，具有断裂DNA的作用，而辅基蛋白的主要作用是保护发色团。大量研究表明，力达霉素具有较强的抗肿瘤活性［2－4］。

本实验结果显示，LDM浓度依赖性抑制SP2/0细胞增殖、诱导细胞凋亡。凋亡诱导作用与LDM浓度依赖性降低SP2/0细胞NF-κB、BCL-2和survivin的表达，上调Bax蛋白有关，LDM可使SP2/0细胞周期阻滞于G2/M期，这与浓度依赖性上调P27蛋白的表达有关。Caspase是细胞凋亡的核心所在。各种引起凋亡的因素，无论是Fas死亡因子、肿瘤坏死因子、CTL细胞分泌的 granzyme B、ceramide及P53等均先激活caspase才能导致细胞凋亡，PARP是caspase家族的切割底物，是细胞凋亡的一个早期分子标志。

NF-κB是一个与肿瘤生成有关的生存因子，它的活化会使肿瘤细胞对凋亡产生抗性［5］。BCL-2是一种抗凋亡蛋白，它可以通过与Bax形成异源二聚体而起到抗凋亡作用，研究认为，BAX与BCL-2的表达比例决定细胞的生存与凋亡［6－7］。Survivin是凋亡抑制蛋白 (inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的成员，可通过抑制caspase-3、caspase-7阻断细胞凋亡。研究表明，survivin除抑制细胞凋亡外，还与细胞周期、血管形成、肿瘤的浸润、转移、耐药和放疗抗拒等有关［8］。P27是一种细胞周期负性调控因子。

为了进一步研究LDM抗骨髓瘤的作用，采用小鼠骨髓瘤SP2/0细胞移植成瘤模型，结果显示，LDM对SP2/0细胞移植瘤的生长有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性，与对照组相比有显著性差异。因接种后第10天0.1 mg/kg LDM剂量组有一只死亡，表明动物不能耐受该剂量。在实验期间，虽然0.1 mg/kg LDM剂量组体重下降，但与对照组相比，没有显著性差异。实验小鼠无其他毒性反应。

综上所述，LDM能够通过降低 SP2/0细胞NF-κB、BCL-2和 Survivin的表达，上调 BAX表达，抑制鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞增殖，诱导其凋亡。通过上调P27蛋白的表达，使SP2/0细胞周期阻滞于G2/M期，而且LDM对SP2/0细胞移植瘤的生长有明显的抑制作用。本实验为LDM抗人多发性骨髓瘤的体内实验和临床实验研究提供了理论依据。

［1］Leiba M，Jakubikova J，Klippel S，et al．Halofuginone inhibits multiple myeloma growth in vitro and in vivo and enhances cytotoxicity of conventional and novel agents［J］．Br J Haematol，2012，157:718 －731．

［2］Zhong GS，Guo XF，Zhang SH，et al．Optimization of the assembly efficiency for lidamycin chromophore bound to its apoprotein:a case study using orthogonal array［J］．Biomed Environ Sci，2011，24:602 －607．

［3］Zhang Q，Liu XJ，Hu L，et al．Factor VII light chain-targeted lidamycin targets tissue factor-overexpressing tumor cells for cancer therapy ［J］．Int J Mol Med，2012，29:409－415．

［4］Zhen HY，He QH，Zhen YZ，et al．Inhibition of mouse embryonic carcinoma cell growth by lidamycin through down-regulation of embryonic stem cell-like genes Oct4，Sox2 and Myc［J］．Invest New Drugs，2011，29:1188 －1197．

［5］Sohma I，Fujiwara Y，Sugita Y，et al．Parthenolide，An NF-{kappa}B Inhibitor，Suppresses Tumor Growth and Enhances Response to Chemotherapy in Gastric Cancer［J］．Cancer Genomics Proteomics，2011，8:39 －47．

［6］刘安恒，曹亚南，张卫卫，等．DIDS对BCL-2/Bax在staurosporine诱导心肌细胞凋亡中表达的影响［J］．中国药理学通报，2009，25:47 －50．

［7］申梅淑，宋明勋，王桂云．双歧杆菌脂磷壁酸对衰老小鼠胸腺细胞凋亡及BCL-2和Bax蛋白表达的影响［J］．医学综述，2010，16:2681 －2682．

［8］Hideshima T，Catley L，Raje N，et al．Inhibition of Akt induces significant downregulation of survivin and cytotoxicity in human multiple myeloma cells ［J］．Br J Haematol，2007，138:783－791．