余海浪，马文丽*，周珏宇，孟 伟，石 嵘，郑文岭

(1.南方医科大学基因工程研究所，广东广州510515;2.华南基因组研究中心，广东广州510800)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，远处转移已成为乳腺癌患者死亡的主要原因。Ⅰ型胶原α1链基因(collagen type 1 alpha 1，COL1A1)是细胞外基质的重要组成成分，对细胞的黏附、分化有重要作用。研究发现，COL1A1基因在乳腺导管癌和乳腺小叶癌中均有不同程度的高表达，并且可能与乳腺癌的发生和转移存在一定相关性［1－2］。有关COL1A1基因在乳腺癌发生发展中的作用机制国内尚未见报道。本实验通过RNA干扰技术体外下调乳腺癌MDA-MB-231细胞中COL1A1的表达，并检测干扰前后乳腺癌细胞迁移侵袭能力的变化，为寻找乳腺癌基因靶向治疗新靶点提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人乳腺癌细胞系MDA-MB-231(南方医科大学基因所保存);小鼠成纤维细胞NIH3T3(中科院上海细胞所);pSilencer2.1-U6-COL1A1(pshRNACOL1A1)、pSilencer2.1-U6-scramble(pshRNAScramble)重组质粒均(南方医科大学基因所前期构建);Transwell小室(Corning公司);Matrigel(BD公司)LipofectamineTM2000(Invitrogen公司);胎牛血清(杭州四季青公司);RPMI 1640培养基(Gibco公司);COL1A1鼠抗人多克隆抗体、兔抗人β-actin单克隆抗体(Santa Cruz公司);HRP标记的羊抗鼠IgG、HRP标记的羊抗兔 IgG(北京中山公司);G418、氨苄青霉素、MTT、Giemsa(Sigma公司)

1.2 方法

1.2.1 寡核苷酸序列的设计与合成:根据GenBank人COL1A1基因全长 mRNA序列(NM_000088)，按照Tuschl设计原则［3］，选取其中两个位点TGAAGG AACGGTGTATGAA(877－895)和 GTACGTCCGGTT GTATGTA(2065－2083)作为靶序列，分别命名为pshRNA-COL1A1-1和 pshRNA-COL1A1-2，另 将pshRNA-COL1A1-2随机打乱顺序的序列作为阴性对照，命名为pshRNA-scramble，所有序列均经Blast比较，与人、鼠基因库无明显同源性。根据不同靶点序列及pSilencerTM2.1-U6 neo表达载体的克隆需要合成发夹shRNA转录模板寡核苷酸序列，将寡核苷酸片段退火形成双链结构后与线性化的pSilencerTM2.1-U6 neo载体连接，连接产物加入到DH5α感受态细菌中，转化并扩增获得pSilencer/neo-shRNA表达质粒并测序。

1.2.2 pshRNA-COL1A1表达载体的构建:乳腺癌细胞系MDA-MB-231用含10%胎牛血清的RPMI 1640常规培养传代。转染实验参照LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)产品说明书，转染前一天将细胞以2×105个/孔接种于6孔培养板，细胞汇合达90% ～95%时进行转染，用OPTI-MEM培养液稀释质粒载体和脂质体。转染后24 h在培养液中加入1 mg/mL G418进行筛选。形成阳性单细胞克隆群落后，用尖吸管吸取单克隆阳性细胞培养，连续培养3周后以含400 mg/L G418的培养液维持培养。

1.2.3 Western blot检测COL1A1蛋白表达水平:采用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，每孔上样50 μg进行10%SDS-PAGE，半干电转PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h后依次与鼠抗人COL1A1多抗(1∶200)、兔抗人 β-actin(1∶1 000)单抗4 ℃过夜，再与羊抗鼠IgG/HRP及羊抗兔IgG/HRP孵育37℃孵育1 h，ECL显色。Scion Image软件进行吸光度扫描分析蛋白表达的相对值。

1.2.4 平板集落形成实验:细胞达对数生长期后，以每孔500个细胞分别接种于含2 mL 37℃预温培养液的6孔培养板中，37℃，5%CO2培养箱中培养2周，肉眼观察集落形成情况，终止培养后常规PBS漂洗，甲醇固定，Giemsa染色，显微镜下计数大于50个细胞的集落数，用下式计算集落形成率:集落数/接种细胞数×100%。重复3次，取平均值。

1.2.5 细胞黏附实验:参照Yang等［4］方法稍加修饰，Matrigel 1∶8稀释液(100 μL/孔)包被 96 孔培养板后4℃过夜。吸出培养板中残余液体，每孔加入50 μL RPMI1640无血清培养液，37℃孵育30 min待用。分别取各组单细胞悬液100 μL(5×103个/孔)接种于包被Matrigel的96孔板中，每组设5个平行复孔。48 h后，37℃ PBS洗去未黏附的细胞，黏附细胞经MTT细胞增殖试剂测定吸光度值进行评估，以A值大小表示黏附活细胞数的相对多少。

1.2.6 侵袭实验:采用Transwell小室实验检测细胞的侵袭能力［5］。将50 μg/L的 Matrigel稀释液均匀平铺在Transwell上室内，下室加NIH3T3细胞培养上清作为趋化因子。取各组转染48 h的单细胞悬液100 μL(1 ×105个/室)接种于 Transwell上室内，每组设3个复孔，37℃，5%CO2培养24 h，棉签轻轻擦去未穿膜细胞和Matrigel胶，取膜、甲醇固定、Giemsa染色，风干，揭下滤膜后反贴在载玻片上。取倒置显微镜下随机3个视野，计算每个视野的平均穿膜细胞数，实验重复3次。

1.2.7 迁移实验:不铺Matrigel胶，其余步骤同侵袭实验。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Western blot检测COL1A1基因沉默后COL1A1蛋白的表达

实验组MDA-MB-231细胞中COL1A1蛋白抑制率分别为45.50% ±2.71%和66.98% ±2.08%，显著高于空白对照组的2.07%±0.13%和阴性对照组的3.11% ±0.20%(P＜0.05)(图1)。且实验组pshRNA-COL1A1-2中细胞COL1A1蛋白相对表达量的下调程度大于实验组pshRNA-COL1A1-1，因此选取pshRNA-COL1A1-2(pshRNA-COL1A1)实验组作为有效干扰组进行后续功能实验。

图1 转染后各组细胞COL1A1的蛋白表达Fig 1 Expression of COL1A1 after being transfected

2.2 特异性pshRNA-COL1A1对MDA-MB-231细胞集落形成的影响

pshRNA-COL1A1组细胞平均集落形成率(43.76% ±1.56%)与control组(76.68% ±1.34%)和pshRNA-scramble组(72.68% ±0.77%)相比显著降低(P＜0.05)(图2)。

2.3 特异性pshRNA-COL1A1对MDA-MB-231细胞黏附的影响

pshRNA-COL1A1组细胞的黏附能力明显受抑制，其A值0.21±0.06显著低于control组和pshRNA-scramble组的0.42±0.04和0.40±0.02(P＜0.001)(图3)。

图2 各组细胞平板集落形成实验结果Fig 2 The results of monolayer colony formation assay in different groups(×100)

A.control;B.pshRNA-Scramble;C.pshRNA-COL1A1

图3 MTT法检测3组细胞的黏附能力Fig 3 Effect of shRNA targeting COL1A1 on the ability of adhesion by MTT

2.4 特异性pshRNA-COL1A1对MDA-MB-231细胞体外迁移能力的影响

pshRNA-COL1A1组穿膜细胞数为(325±13)个，显著少于control组和pshRNA-scramble组的穿膜细胞数(701±21)个和(667±18)个(P＜0.001)(图4)。

2.5 特异性pshRNA-COL1A1对MDA-MB-231细胞侵袭力的影响

pshRNA-COL1A1组细胞侵袭Matrigel胶的穿膜细胞数为(106±8)个，显著少于 control组和pshRNA-scramble组的穿膜细胞数(204±13)个和(187±9)个(P＜0.001)(图5)。

3 讨论

迁移和侵袭表型的获得是肿瘤发展和转移的关键步骤，也是一个极其复杂的病理过程，与肿瘤患者病情的发展和预后有密切的关系［6］。COL1A1基因全长17 537 bp，含有51个外显子，位于染色体17q21.33，编码Ⅰ型胶原纤维的前α1链，是细胞外基质(extracellularmatrix)的重要组成成分，对细胞的黏附、分化有重要作用［7］。已有证据表明，Ⅰ型胶原可以通过诱导E-钙黏蛋白介导的细胞间黏附复合物解聚及β-链蛋白的核转位而促进胰腺癌细胞的扩散及增殖［8］。另有报道，COL1A1-shRNA 转染胃癌BGC-823细胞能有效抑制细胞COL1A1的表达及癌细胞的增殖迁移［9］。近年研究发现，在乳腺癌的发生发展过程中也存在COL1A1基因的异常表达［1－2］，且可能与肿瘤的预后有关［10］，但COL1A1基因对乳腺癌细胞转移的影响目前知之甚少。为此，本研究首先构建COL1A1基因的2个RNA干扰载体，通过转染及稳定筛选获得了稳定表达2种干扰载体的MDA-MB-231细胞系，并筛选出抑制 MDA-MB-231细胞中COL1A1蛋白表达最明显的干扰载体。

本研究发现，pshRNA-COL1A1转染乳腺癌MDA-MB-231细胞导致乳腺癌细胞增殖减慢，细胞迁移能力下降，说明本研究构建的siRNA表达载体不仅能够在细胞内抑制COL1A1基因表达，减少Ⅰ型胶原的合成，而且能够抑制乳腺癌细胞的增殖迁移;而阴性对照组与空白对照组比较则无明显差异，因此可以排除质粒及转染所用试剂本身对基因的抑制作用。这些结果也进一步说明Ⅰ型胶原可能在乳腺癌的侵袭转移中发挥了重要作用。

结合本研究结果，从多方面证明了COL1A1基因表达下调可有效降低乳腺癌细胞MDA-MB-231的运动侵袭能力，为进一步深入阐明乳腺癌发生、发展和转移的分子机制、加深对COL1A1基因功能的了解以及为研究乳腺癌基因治疗的可能性提供实验基础。

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