赵 蕊，严启滔，吕静野，黄海丽，马文丽

(南方医科大学基因工程研究所，广东广州510515)

结肠癌在我国的发病率近年来有逐年增高的趋势，其死亡率也成为仅次于肺癌和肝癌，占我国恶性肿瘤的第3位。越来越多的文献报道了结肠癌发生发展的各个阶段都有特异性分子的参与，并且将这些特异性分子作为临床治疗的靶标，如S-腺苷甲硫胺酸可以使C-MYC启动子区恢复甲基化水平，从而可以作为结肠癌治疗的抗癌药物等［1］。在前期的研究中已经发现染色质解旋酶DNA结合蛋白5(CHD5)基因能抑制结肠癌细胞增殖，并且利用RNAi方法成功干扰CHD5的表达后，提高了结肠癌细胞的增殖，因此CHD5可能是结肠癌的一个肿瘤候选抑制基因，但其肿瘤抑制机制还不清楚［2］。本研究分析了5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine)对CHD5在2株结肠癌细胞中的甲基化及其mRNA表达的影响，为揭示CHD5在结肠癌中发病的分子机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

293、Lovo、SW480 细胞和大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)DH5α为本实验室保存;DNA凝胶回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒、基因组DNA提取试剂盒、EpiTect Bisulfite试剂盒、反转录试剂盒(Quanti-Tect Rev.Transcription kit)、qPCR(SYBR 法)(Qiagen公司);Premix Ex TaqTMHot Start Version、PCR产物克隆载体pMD18-T Vector(TaKaRa公司);10%胎牛血清(杭州四季青公司);DMEM培养液中(Gibco公司);AZA(Sigma);Trizol(Invitrogen)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:293、Lovo、SW480按常规培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中。实验时取处于对数生长期的细胞，其活细胞数达95%～100%。

1.2.2 Bisulfite Sequencing PCR(BSP)检测结肠癌细胞中CHD5的甲基化水平:提取2株结肠癌细胞(Lovo和SW480)的基因组DNA，按照EpiTect Bisulfite试剂盒说明书用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，DNA经亚硫酸盐处理后，设计BSP引物扩增目的片段。BSP引物分别为:5'-TTTAGGGGTTTG TATGGGTTTTAG-3'，5'-CCCTCTCCAAAAAAAATTA AAAAA-3'，反应条件为94℃ ×5 min;94℃ ×30 s，55℃ ×30 s，72℃ ×30 s，40 个循环;72℃ ×10 min，扩增片段长度为201 bp。将扩增获得的PCR产物纯化后与pMD18-T载体进行连接，并转化至大肠杆菌DH5α。每个细胞系至少挑取10个单克隆进行酶切鉴定和测序鉴定，并用BiQ Analyzer软件对甲基化状况进行分析。

1.2.3 实时荧光定量 PCR(qPCR)检测结肠癌细胞中CHD5 mRNA的表达:用 Trizol试剂抽提细胞总RNA，按QuantiTect Rev.Transcription Kit反转录试剂盒说明书和qPCR(SYBR法)说明书分别进行反转录和实时荧光定量PCR反应。qPCR引物分别为:5'-TCCGCAAGCAGGTCAACTACA-3'，5'-CTCA TCCTCAGAGCCAATGGAA-3';反应条件为:95℃预变性30 s;95℃ 5 s，60℃退火34 s，共40个循环。每个实验重复3次取平均值。

1.2.4 5-Aza-2-deoxycytidine(AZA)体外诱导结肠癌细胞系去甲基化:将Lovo和SW480细胞接种于75 mL培养瓶中过夜，向培养基中加入AZA至终浓度5 μmol/L，每24 h更换1次培养基，连续处理72 h后用Trizol提取总RNA，检测CHD5在mRNA水平上的表达，并用BSP方法分析其甲基化状况。每个实验重复3次取平均值。

1.2.5 MTT(［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide］)检测:取对数生长期的细胞1×106/L接种于3块96孔培养板，过夜贴壁后加入5 μmol/L AZA每孔200 μL，每组设6个复孔，并设不加药的对照组。试剂和培养液每24 h更换1次，每天取出1板，加入20 μL MTT(5 g/L)，37℃培养箱内继续孵育4 h后，直接加入Formazan溶解液溶解formazan在酶标仪上测定570 nm波长处的吸光度值。

1.3 统计学分析

应用SPSS 13.0软件，双侧检验法进行统计学分析。

2 结果

2.1 荧光定量PCR检测5-氮杂胞苷对CHD5 mRNA基因在结肠癌细胞中表达的影响

Lovo和SW480细胞中CHD5基因的转录在5-氮杂胞苷处理后明显增强，且呈时间依赖性(图1)。

2.2 5-氮杂胞苷对结肠癌细胞CHD5启动子区的甲基化水平的影响

BSP获得的特异性扩增片段与预期的大小一致(图2)。对筛选出的pMD18T-BSP阳性克隆质粒，进行酶切鉴定(EcoRⅠ/HindⅢ)和测序鉴定。部分酶切结果如图3显示，目的片段与预期大小一致。

2个结肠癌细胞系Lovo、SW480中CHD5基因启动子区的甲基化状况在AZA处理72 h后明显降低(图4)，Lovo和SW480细胞的甲基化水平分别降低了52.9%和42.9%，因此，AZA体外诱导结肠癌细胞系后，Lovo和SW480细胞发生了明显的去甲基化。

2.3 5-氮杂胞苷对结肠癌细胞增殖的影响

与AZA处理前相比，5 μmol/L AZA处理后的结肠癌细胞Lovo和SW480增殖受到了明显的抑制(图5)。

3 讨论

图5 5-氮杂胞苷处理后对结肠癌细胞增殖的影响Fig 5 The effect of AZA on proliferation

随着表观遗传学研究的深入，越来越多的报道证实了肿瘤的发病机制与抑癌基因的异常甲基化相关。结肠癌是常见的恶性肿瘤，其发病机制与多种基因的异常表达相关，启动子区的异常甲基化是导致抑癌基因失活的一个最常见的原因，目前已有相关文献报道，结肠癌中多个抑癌基因由于启动子区的甲基化导致失活的，如P16在结肠癌细胞系中存在着异常甲基化［3］。有大量文献报道在各肿瘤中存在着CHD5基因的缺失，如神经母细胞瘤［4］、脑膜瘤［5］等，并且在神经肿瘤、乳腺癌［6-9］中 CHD5 启动子区发生了超甲基化。那么表观遗传学失活可能是CHD5在肿瘤中失去活性的主要原因。通过前期的研究证实了CHD5基因是结肠癌的一个肿瘤候选抑制基因［2］，为了更进一步的研究其在结肠癌中的生物学行为，本研究选用甲基化抑制剂5-氮杂胞苷作用于结肠癌细胞，5-氮杂胞苷做为甲基化抑制剂，其通过与DNA甲基化转移酶共价结合［10］，达到CpG岛去甲基化，使CHD5重新表达，降低酶的生物活性，从而起到抑制甲基化效应，恢复基因转录水平的作用。结合5-氮杂胞苷处理前后CHD5基因表达的改变，可以推测启动子区异常甲基化是结肠癌细胞CHD5基因失活的主要原因之一。5-氮杂胞苷通过反转CHD5基因甲基化状态，恢复CHD5基因表达。当然这也并不能排除还存在其他的原因导致了CHD5基因的缺失，这还需要进一步的证实。经过5-氮杂胞苷处理后，结肠癌细胞的增殖活性降低，表明细胞的恶性程度受到了一定的抑制，并且具有随时间延长而增强的趋势。此研究可以为结肠癌的治疗提供一个新方法，为去甲基化治疗肿瘤提供了又一个可靠的例证。

［1］Sharrard RM，Royds JA，Rogers S，et al.Patterns of methylation of the c-myc gene in human colorectal cancer progression［J］.Br J Cancer，1992，65:667-672.

［2］赵蕊，吕静野，黄海丽，等，CHD5基因RNAi慢病毒载体的构建及其对结直肠癌细胞生物学功能的影响［J］.中国生物工程，2012，32:7-11.

［3］刘丽乔，罗达亚，付晶晶，等，5-Aza-CdR对人结肠癌Caco-2细胞系P16基因甲基化状态及其生物学表型的影响［J］.基础医学与临床，2011，31:161-165.

［4］White PS，Thompson PM，Gotoh T，et al.Definition and characterization of a region of 1p36.3 consistently deleted in neuroblastoma［J］.Oncogene，2005，24:2684-2694.

［5］Piaskowski S，Rieske P，Szybka M，et al.GADD45A and EPB41 as tumor suppressor genes in meningioma pathogenesis［J］.Cancer Genet Cytogenet，2005，162:63-67.

［6］Fujita T，Igarashi J，Okawa ER，et al.CHD5，a tumor suppressor gene deleted from 1p36.31 in neuroblastomas［J］.J Natl Cancer Inst，2008，100:940-949.

［7］Thompson PM，Gotoh T，Kok，et al.CHD5，a new member of the chromodomain gene family，is preferentially ex-pressed in the nervous system［J］.Oncogene，2003，22:1002-1011.

［8］Mulero-Navarro S，Esteller M，Chromatin remodeling factor CHD5 is silenced by promoter CpG island hypermethylation in human cancer［J］.Epigenetics，2008，3:210-215.

［9］Zhao R，Yan Q，Lv J，et al.CHD5，a tumor suppressor that is epigenetically silenced in lung cancer［J］，Lung Cancer，2012，76:324-331.

［10］Nguyen CT，Weisenberger DJ，Velicescu M.et al.Histone H3-lysine 9 methylation is associated with aberrant gene silencing in cancer cells and is rapidly reversed by 5-Aza-2'-deoxycytidine［J］.Cancer Res，2002，62:6456-6461.