王 秦，成 凤，匡文斌，董晋豫，马婷婷，熊海玉，涂植光

(重庆医科大学检验医学院临床检验诊断学教育部重点试验室，重庆400016)

卵巢癌是临床上常见的女性恶性肿瘤，目前国内卵巢癌的治疗主要以外科手术为主，同时辅以化疗、放疗或者其他的治疗方法。由于卵巢癌恶性程度高，对化疗、放疗不敏感，卵巢癌成为女性生殖器恶性肿瘤中病死率最高的肿瘤［1－2］。

近年来，肿瘤的基因治疗成为人们研究的热点，目前常用的载体主要有病毒载体和非病毒载体，其中腺病毒具有制备方便、转染效率高、不整合宿主染色体等优点而被广泛地作为肿瘤的基因治疗载体，尤其近年来新型嵌合型腺病毒Ad5F35的广泛应用，使造血干细胞、树突状细胞、T细胞及NK细胞等难转染血液细胞的外源基因转染和高效表达成为可能［3－5］。

本研究探讨过表达人IL-12的淋巴细胞在肿瘤微环境中对卵巢癌细胞的杀伤作用，为进一步研究肿瘤局部微环境免疫反应和IL-12的基因治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞系SKOV3(本实验室保存)，肝素钠抗凝全血标本5 mL经健康供血者知情同意后获取，Ad-GFP(本实验室保存)，人IL-12重组腺病毒 Ad-IL-12(本实验前期构建)［6］。Trizol、反转录试剂盒、DNA Maker(TaKaRa公司)，人IL-12 P70 ELISA检测试剂盒(R＆D公司)，磷酸盐平衡盐溶液(武汉博士德公司)，人淋巴细胞分离液Ficoll-Paque PLUS(GE公司)，D-Hanks缓冲液(Hyclone公司)，刘氏染液(珠海贝索生物技术公司)，孔径0.4 μm共培养小室(Corning公司)，RPMI-1640培养液和胎牛血清(Gibco公司)，CCK-8试剂盒和AnnexinⅤ-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物公司)，兔抗人BCL-2多克隆抗体、鼠抗人β-actin单克隆抗体、山羊抗兔二抗及山羊抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，兔抗人survivin多克隆抗体(Anbo Biotechnology公司)。IL-12 P35、P40 引物，Survivin，BCL-2 和 β-actin引物由大连宝生物技术公司合成。

1.2 方法

1.2.1 卵巢癌细胞培养:人卵巢癌细胞SKOV3用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素、100 pg/mL链霉素的RPMI-1640培养基，置于37℃、5%CO2孵箱中培养。每日于显微镜下观察细胞生长情况，细胞每日换液，隔日传代1次，均选用对数生长期细胞进行实验研究。

1.2.2 外周血淋巴细胞的分离和培养:无菌抽取新鲜肝素钠抗凝全血标本5 mL，向血液中按照1∶1比例加入D-Hanks缓冲液，轻轻混匀后吸取5 mL细胞悬液缓慢加在5 mL的淋巴细胞分离液上，室温2 000 r/min离心20 min，离心后收集环状乳白色单个核细胞，加入D-Hanks缓冲液洗涤细胞3次，最后用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液重悬细胞，培养2 h后收集悬浮细胞即为淋巴细胞，细胞置于37℃、5%CO2孵育箱中培养。

1.2.3 重组腺病毒Ad-IL-12感染人外周血淋巴细胞:人外周血淋巴细胞以1×106个细胞接种6孔板，每个孔中加入2 mL含l0%胎牛血清的RPMI-1640培养基，设 SKOV3组，SKOV3/Ad-GFP组，SKOV3/Ad-IL-12组3个实验组，SKOV3组是空白对照，不加入病毒，SKOV3/Ad-GFP组和 SKOV3/Ad-IL-12组分别加入感染复数为100的Ad-GFP和Ad-IL-12病毒，孵育48 h后观察计数荧光染色细胞的比值并采集图片。

1.2.4 RT-PCR检测IL-12双亚基P35和P40的mRNA表达情况:收集培养48 h的3组淋巴细胞(SKOV3组，SKOV3/Ad-GFP组，SKOV3/Ad-IL-12组)，按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA并反转录成cDNA，以β-actin基因为内参基因进行PCR反应。引物序列如下:β-actin基因(NM-001101.3)上游引物为:5'-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3'，下游引物为:5'-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3'，扩增产物片段大小为564 bp;P40基因(NM_002187.2)上游引物为:5'-GTGGAGTGCCAGGAGGACA-3'，下游引物为:5'-TCTTGGGTGGGTCAGGTTT-3'，扩增产物片段大小为148 bp;P35基因(NM_000882.3)上游引物为:5'-CTGGACCACCTCAGTTTGG-3'，下游引物为:5'-TCAGAAGTGCAAGGGTAAAA-3'，扩增产物片段大小为155 bp，PCR反应条件均为:94℃预变性5 min，94 ℃ 变性30 s，56 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，共35个循环，最后充分延伸5 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶(2.5%)电泳鉴定，采用Quantity One软件对图像进行分析，实验重复3次。

1.2.5 ELISA检测细胞培养上清中的IL-12 P70蛋白:收集培养72 h的3组细胞培养上清，10 000 r/min离心5 min，吸取上清，按照人IL-12 P70 ELISA试剂盒说明书进行操作。实验重复3次。

1.2.6 Ad-IL-12及Ad-GFP感染的人外周血淋巴细胞与SKOV3细胞共培养:取新鲜分离的外周血淋巴细胞接种于6孔板中，每孔细胞总数为1×106个，设SKOV3组，SKOV3/Ad-GFP组，SKOV3/Ad-IL-12组3个实验组，SKOV3/Ad-GFP组和SKOV3/Ad-IL-12组加入感染复数为100的相应病毒感染淋巴细胞48 h后，再与SKOV3细胞共培养，SKOV3细胞接种在共培养小室上层，每孔细胞总数为2×105个。实验重复3次。

1.2.7 CCK8检测SKOV3细胞增殖:取共培养72 h后的3组SKOV3细胞加入到96孔板中，每孔细胞总数为1×104个并加入200 μL与共培养体系对应的旧培养基。同时设立 SKOV3组，SKOV3/Ad-GFP组，SKOV3/Ad-IL-12组3个实验组，每组设5个平行孔，分别在1～5 d内定时按照CCK8说明书进行检测。实验重复3次。

1.2.8 流式细胞术检测SKOV3细胞周期:外周血淋巴细胞与SKOV3细胞共培养72 h后，收集3组SKOV3细胞，70%冰乙醇中固定细胞后送重庆医科大学儿童医院儿研所检测细胞周期。实验重复3次。

1.2.9 流式细胞术检测SKOV3细胞凋亡:采用流式细胞仪分别检测共培养24、48、72 h后SKOV3细胞的凋亡峰，再按照AnnexinⅤ-PE/7-AAD试剂盒说明书检测出现凋亡峰的时间点所对应的SKOV3细胞凋亡率。实验重复3次。

1.2.10 RT-PCR检测抗凋亡基因 survivin、BCL-2 mRNA的表达:收集共培养72 h后的各组SKOV3细胞，Trizol抽提总RNA，反转录合成cDNA，进行PCR检测。以人β-actin为内参，RT-PCR法分别检测各组细胞抗凋亡基因survivin，BCL-2 mRNA的表达。引物序列如下:BCL-2基因(NM-000657.2)上游引物为:5'-TTGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3'，下游引物为:5'-CACCTACCCAGCCTCCGTTAT-3'，扩增产物片段大小为153 bp;survivin基因(NM_001168.2)上游引物为:5'-TTCTCAAGGACCACCGCATCT-3'，下游引物为:5'-CGCACTTTCTCCGCAGTTTC-3'，扩增产物片段大小为358 bp。

1.2.11 Western blot检测survivin、BCL-2蛋白的表达:收集共培养72 h后的各组SKOV3细胞，提取细胞总蛋白，BCA法测蛋白浓度。取90 μg细胞蛋白提取液，采用12%的分离胶分离蛋白质，半干转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，分别与兔抗人 survivin、BCL-2多克隆抗体(1∶500稀释)4℃孵育过夜后，与二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，1∶1 000稀释)37℃孵育2 h，洗涤后用化学发光进行显色。实验重复3次。

1.3 统计学分析

采用软件SPSS16.0对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间均数比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 Ad-IL-12成功感染人外周血淋巴细胞

重组腺病毒感染人外周血淋巴细胞48 h后，发现Ad-IL-12和Ad-GFP均能够成功感染人外周血淋巴细胞，在激发光下发出绿色荧光，感染效率分别为(95±1)%和(92±1)%(图1)。

2.2 Ad-IL-12感染外周血淋巴细胞48 h后IL-12 mRNA表达情况

与SKOV3组和感染Ad-GFP的淋巴细胞相比，Ad-IL-12感染的淋巴细胞能扩增出大小为148 bp的P40亚基和155 bp的P35亚基目的条带(图2)。

2.3 ELISA检测细胞培养上清中IL-12 P70的表达

根据标准曲线y=489.2x－57.29(R2=0.994)计算细胞培养上清中的人IL-12 P70浓度，SKOV3/Ad-IL-12组浓度是263 pg/mL，而 SKOV3组和 SKOV3/Ad-GFP组均未检出。

2.4 过表达IL-12的人外周血淋巴细胞对SKOV3细胞增殖活性的影响

前3天3组SKOV3细胞增殖率无显著差异，到第4天，与 SKOV3组和 SKOV3/Ad-GFP组相比，SKOV3/Ad-IL-12组的SKOV3细胞增殖率显著下降(P＜0.05)(图3)。

2.5 过表达IL-12的人外周血淋巴细胞对SKOV3细胞周期的影响

共培养72 h后，与SKOV3/Ad-GFP组和SKOV3组相比，SKOV3/Ad-IL-12组的SKOV3细胞G1期百分比显著升高(P＜0.05)(图4，表1)。

2.6 过表达IL-12的人外周血淋巴细胞升高SKOV3细胞凋亡率

共培养24和48 h，3组细胞均未出现凋亡峰，共培养72 h后，与 SKOV3组和 SKOV3/Ad-GFP组相比，SKOV3/Ad-IL-12组的SKOV3细胞开始出现明显的凋亡峰(图5)。AnnexinⅤ-PE/7-AAD法检测出SKOV3/Ad-IL-12组细胞凋亡率(2.40±0.52)%显著高于SKOV3组(0.64±0.10)%和SKOV3/Ad-GFP组(0.83±0.03)%(图6，表1)。

2.7 过表达IL-12的人外周血淋巴细胞下调SKOV3细胞survivin、BCL-2 mRNA的表达

共培养72 h后，与SKOV3/Ad-GFP组和SKOV3组相比，SKOV3/Ad-IL-12组的SKOV3细胞survivin、BCL-2 mRNA水平显著下调(P＜0.05)(图7)。

2.8 过表达IL-12的人外周血淋巴细胞下调SKOV3细胞 survivin、BCL-2 蛋白

共培养72 h后，与SKOV3/Ad-GFP组和SKOV3组相比，SKOV3/Ad-IL-12组SKOV3细胞的抗凋亡蛋白survivin、BCL-2均显著下调(P＜0.05)(图8)。

3 讨论

人白细胞介素 12(humaninterleukin-12，hIL-12)是由P35和P40两个亚基组成的异源二聚体，主要由单核巨噬细胞、树突状细胞、淋巴细胞和中性粒细胞产生。它可以调节淋巴细胞的增殖，诱导Th0细胞向Thl细胞分化，刺激T细胞和NK细胞产生IFN-γ，促进NK和LAK细胞的杀伤水平和黏附分子的表达等［7］。早在2000年，国外已生产出重组人IL-12应用于抗肿瘤治疗，并进行了一、二期临床实验，但是临床实验发现全身应用外源性的IL-12存在不良反应大，半衰期短等问题，所以如何能让IL-12在肿瘤局部高效持续的表达成为研究难题。近年来，肿瘤的基因治疗技术得到极大的发展，IL-12基因疫苗、微粒体携带IL-12、IL-12重组质粒电转入瘤体等方法都得到了较好的抗肿瘤效果［8－10］，也有报道指出，在结肠癌中采用腺病毒载体运载IL-12基因联合化疗药物可以更好地在肿瘤局部发挥抗肿瘤免疫反应［11－12］。所以本研究采用具有高转染率的腺病毒载体作为IL-12基因治疗的载体。

图4 流式细胞术检测各组SKOV3细胞周期分布Fig 4 The cell cycle distribution of SKOV3 cells in different groups detected by FCM

表1 流式细胞术检测各组SKOV3细胞周期分布和凋亡的影响Table 1 The cell cycle distribution and apoptosis rate of SKOV3 cells in different groups detected by FCM(±s，%，n=3)

表1 流式细胞术检测各组SKOV3细胞周期分布和凋亡的影响Table 1 The cell cycle distribution and apoptosis rate of SKOV3 cells in different groups detected by FCM(±s，%，n=3)

*P ＜0.05 compared with SKOV3 group and SKOV3/Ad-GFP group．

group apoptosis G1 S G2 SKOV3 0.64±0.10 33.41±0.78 66.43±1.02 0.17±0.02±0.04 0.29 SKOV3/Ad-GFP 0.83±0.03 29.34±0.77 70.66±0.77 0 SKOV3/Ad-IL-12 2.40±0.52* 53.74±0.29* 46.24±0.27*

大量的动物实验表明，IL-12可以抑制肿瘤生长，延长荷瘤动物的生存时间，减少肿瘤转移等，但是人们对IL-12的抗肿瘤机制却不甚清楚，有的认为IL-12是通过刺激免疫细胞产生IFN-γ来发挥作用，有的认为IL-12是通过体内细胞因子网络发挥作用，在不同的肿瘤中有不同的细胞因子的相互作用，从而导致不同的抗瘤效果。目前较为普遍的观点是:IL-12发挥抗瘤作用需要有免疫细胞如淋巴细胞，NK细胞的参与。所以本研究采用IL-12效应细胞之一的外周血淋巴细胞作为其基因转染的靶细胞。

本研究采用重组腺病毒载体Ad-IL-12成功感染人外周血淋巴细胞并可持续表达分泌人IL-12 P70蛋白。过表达IL-12的外周血淋巴细胞可以使与之共培养的人卵巢癌细胞SKOV3周期阻滞在G1期，凋亡率升高，同时也发现SKOV3细胞的抗凋亡蛋白BCL-2和survivin显著下调，从而有效地抑制了细胞的增殖并促进其凋亡。本研究表明，在局部存在高表达IL-12淋巴细胞的肿瘤微环境中，卵巢癌细胞的恶性生物学行为得到抑制，为后续研究卵巢癌基因治疗提供了依据，但具体的机制还需要进一步的研究。

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