苑晓晨，李炳蔚，武清斌，荆瀛黎，盛有明，李宏伟，刘淑英，修瑞娟

(中国医学科学院北京协和医学院微循环研究所，北京100005)

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)的治疗是世界性难题，探讨其发展机制具有重要意义。微循环起着维持组织细胞正常功能活动的作用，可以将其作为研究 SCI的切入点［1－2］。采用激光多普勒技术、氢电极技术等方法观察脊髓微循环得出的相对数值只能间接地反映微循环的变化，直观性不够。而国内报道的脊髓窗技术仅能对血管的管径进行测量，无法观测红细胞(red blood cell，RBC)的流动和白细胞的黏附。此外，这些方法剥离了硬脊膜，需要通过不断的进行人工脑脊液的恒温灌流来维持脊髓的脑脊液平衡，为观察脊髓损伤的慢性病变带来不便。

本实验拟通过荧光标记示踪法来观察脊髓软脊膜血管内RBC的运动和白细胞的黏附滚动，实现对脊髓窗内微循环的有效观测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂:丙烯酸树脂(3M公司)，α-氰基丙烯酸正丁酯生物胶(康派特公司)，1，1'-Dioctadecyl-3，3，3'，3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate(Dil)和Rhodamine 6G(Sigma公司)。Dil工作液的配制与贮存:0.5 mg Dil溶于1 mL无水乙醇，室温避光保存。将3 mg Rhodamine 6G溶于10 mL 0.9%氯化钠注射液中，4℃避光保存。

1.1.2 实验动物:本研究涉及的动物实验经中国医学科学院北京协和医学院微循环研究所伦理委员会审核、批准。SD大鼠［北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK(京)2011-0011］，8周龄雄性，清洁级，体质量250±10 g。

1.2 方法

1.2.1 动物麻醉:腹腔注射10%水合氯醛，0.3 mL/100 g，5～10 min后动物进入麻醉状态。将动物置于恒温电热板上进行操作。

1.2.2 脊髓窗模型的制作:在参考相关文献的基础上进行改进［3］。暴露T9至T11胸椎的椎板。用半凝固的丙烯酸树脂涂抹在大鼠T9和T11的棘突上，形成一个球状物，便于椎体固定器的夹持。在T10椎板上开窗，暴露脊髓但不破坏硬脊膜。磨钻打磨开窗边缘及T9和T11椎板表面，以外径为4.5 mm的塑料管为模具，将半凝固的丙烯酸树脂涂抹在模具和骨窗周围，待其快凝固时将塑料管拔出，丙烯酸树脂可形成一个井型空间。将丙烯酸树脂窗的上表面打磨平整后涂抹生物胶，黏接盖玻片，封闭脊髓窗(图1)。

1.2.3 RBC的分离和荧光标记:参考相关文献［4－5］步骤如下:眼眶取血500 μL，肝素抗凝，4℃，2 000×g离心5 min。吸弃上层血清和中层的白细胞。用林格氏液洗涤离心，获得洗涤后的RBC。取100 μL压积 RBC置于10 mL林格氏液中，向林格氏液中加入100 μL的Dil工作液，避光室温孵育30 min。孵育完成后反复洗涤并离心标记后的RBC，直至上清液中无Dil的红色，即获得可输注的荧光标记红细胞 (Dil-RBC)。最后向收集到的RBC中加入100 μL的林格氏液，充分混匀后备用。

1.2.4 大鼠脊髓窗内的荧光影像观察:将大鼠置于动物活体荧光显微系统下进行观察 (图2):大鼠微循环观测椎体固定器将大鼠的T9和T11的棘突夹持固定，从而降低胸腔起伏造成的对焦干扰。观测血流速度时，通过颈静脉插管注射200 μL的Dil-RBC溶液，活体荧光显微镜下观察 (绿色激发光);观察白细胞黏附时，通过大鼠颈静脉缓慢推注Rhodamine 6G工作液1 mL，绿色激发光源照射下观察。Rhodamine 6G能够标记白细胞 (多核粒细胞、淋巴细胞、单核/巨噬细胞)，而不会标记RBC［6－7］。

图1 大鼠封闭脊髓窗结构示意图Fig 1 Schematic illustration of the closed spinal window

2 结果

2.1 封闭式脊髓窗观测

通过改进的封闭式脊髓窗，可以观察到大鼠脊髓背侧软脊膜内的多根静脉血管。呼吸造成的运动不会阻碍通过脊髓窗观察血管形态、分布特点和血管密度;普通的落射光源下可以清晰的观察血管网的分布、管径和迂曲度等(图3)。

2.2 RBC染色及观测

体外观察Dil孵育后的RBC，绿色激发光下可见RBC呈现橙红色，细胞形态正常，没有其他细胞碎片的存在(图4)。通过绿色激发光可以清晰的观察到RBC在血管内的运动轨迹(图5)。采用细胞的汇聚和分散的方向来区分动脉和静脉。细胞逐渐汇聚的为静脉，细胞逐渐分散的为动脉。

2.3 白细胞染色及观测

在静脉注射罗丹明6G之后，持续观察。10 min后可见白细胞在静脉内壁上黏附滚动(图6)。

3 讨论

图6 在静脉上黏附的罗丹明6G标记的白细胞Fig 6 The Rhodamine 6G-labelled leukocytes adherent to vessels

SCI的病理损害分为原发性和继发性。继发性损伤的机制之一包括血管破坏和痉挛，血细胞的黏附及阻塞等［8］。相关结果多来自于免疫组织化学，活体监测脊髓微循环的研究较少。目前监测脊髓微循环有一定难度。脊髓被包绕在一个相对较为复杂的环境中(骨、脂肪、静脉丛及脑脊液)。营养脊髓的各级血管管径差异小，造影剂充盈效果较差，从而使核磁共振检测技术不适合于用于脊髓的检测［9］。

有学者曾经使用“封闭式脊髓窗”对大鼠脊髓软脊膜进行微循环观察［3］。但是使用普通的斜射光和垂直落射光，硬脊膜会将光线反射造成成像不清。此外，该方法仅能观测血管管径的变化，无法检测血细胞的流动和黏附滚动等微循环状态。如果将硬脊膜剥离，为了保证脑脊液压力的稳定，需要用人工脑脊液恒温持续灌流。此种方法需要将灌流管、灌流泵和恒温系统等设备与动物模型进行对接，比较适合于急性期的观察，对于损伤后的长期的观察不太适用。本实验的优点在于:维持硬脊膜的完整，不需要人工脑脊液的恒温灌流，为慢性实验观察提供了条件。不破坏硬脊膜，也符合经典的Allen's打击模型的制造标准［10］。此外，本实验荧光标记体内的RBC和白细胞(多核粒细胞、淋巴细胞及单核/巨噬细胞)，使得观测直观准确，为探讨血细胞在脊髓损伤中的变化提供了实验基础［11］。而使用专门的背侧固定装置，则可以减少呼吸运动对图像的干扰。

综上所述，通过改进的封闭式脊髓窗和微循环观测椎体固定器，结合分子影像学手段，达到了对大鼠软脊膜上微血管的形态特点、RBC运行状态和白细胞的血管壁黏附滚动进行观察和检测的目的，为脊髓微血管研究提供实验基础。

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