朱 威，洪旭林，余佳伟，付 琴，毛峥嵘*

(浙江大学医学院1.临床一系;2.临床二系，浙江杭州310029;3.病理学与病理生理学系，浙江杭州310058)

B 淋巴细胞发育成熟中，重组活化基因(recombination activating gene，RAG)在介导抗原受体决定区复杂多样的DNA 重组中发挥着核心作用［1］。RAG1 和RAG2 基因在祖B 细胞和前B 细胞阶段被激活，B 细胞成熟后失去功能。由RAG1 和RAG2蛋白组成的RAG 核酸内切酶识别特定的重组基因片段，并将双链DNA 切断为两条重组基因片段和两条编码序列，通过非同源性末端重组(non-homologous end joining，NHEJ)的方式互相结合［2］。重组过程中会产生染色体转位、缺失或嵌入，与淋巴瘤的发生有密切相关［3－4］。本文综合最新研究进展，着重阐述这其中可能存在的一些机制。

1 RAG 基因、蛋白结构及功能

RAG 基因包括RAG1 和RAG2。在人的基因组中，它们以尾对尾的结构形式定位于11 号染色体短臂1 区3 带(11p13)，其编码区位于单独的一个外显子。两个RAG 都有一个非编码的外显子，这可能是起源转座子整合的宿主细胞序列，此外显子后来进化为淋巴系统特异性表达调控序列。在人的RAG2 中，有两个变异剪切外显子，分别是外显子1A和1B。外显子1A 构成主要的起始位点，外显子1B为次要起始位点。RAG1 蛋白包含核心区域和非核心区域。N 端非核心区域还包锌结合二聚域(zincbinding dimerization domain，ZDD)，核心区域可分为3 部分:1)九聚体结合域(nonamer binding domain，NBD);2)中央域;3)C 端(C-term domain，CTD)。RAG2 已被鉴定的区域主要有3 个:1)RAG2 核心组成的N 端，包含6 个杯状二级结构(Kelch-like motif;%96%94s);2)可变动的铰链区;3)C 端非经典种植同源域(plant homeodomain，PHD)。各部分结构的功能如图1 所示［4－5］。

由RAG1、RAG2 以及高迁移率族蛋白(high mobility group 1，HMG1)构成的RAG 综合体［6］，能特异性识别Ig 胚系基因中V、D、J 基因片段两侧的重组信号序列(recombination signal sequences，RSS)，这些信号序列由一个具有回文结构的七聚物和一个富含A/T 的九聚物构成，其间间隔12 或23 bp，正好能允许DNA 螺旋绕成一圈或两圈，从而使七聚体和九聚体紧靠在一起。一次重组过程则由RAG 综合体和分别间隔12 和23 bp的一对信号序列相互作用完成。在DNA 双链断裂后，七聚物和胚系基因片段被切断，形成4 条DNA 末端:一个12 信号的末端，一个23 信号的末端还有两条编码末端。通过非同源性末端重组的方式，两条信号末端结合在一起，两条编码序列结合在一起［4－5］。在NHEJ 过程中，Ku 蛋白先于DNA 末端结合，并吸引artemis-DNA-PKcs 核酸酶综合体。由此打开在RAG 断裂过程中两个编码序列形成的发卡结构［5］。由于遵守“12/23”规则，从而保证了基因片段连接的正确性。人类Ig 重链可变区基因大约有100 个V 片段，9 个J 片段，10 ～20 个D 片段，这些片段在胚系基因组染色体上是线性不连续的排列。在淋巴细胞分化发育过程中，发生V(D)J 基因重排，产生具有功能的基因，是T 和B淋巴细胞成熟必不可少的［7］。

Ku80 通过NHEJ 方式修复DNA 双链断裂(DNA double-stranded breaks，DSBs)来抑制肿瘤的发生。研究发现，在小鼠中Ku80 单独缺失不会导致肿瘤发生率的增加，但是当Ku80 和P53 同时缺乏使RAG1 蛋白介导的DSBs 非同源性末端重组修复缺陷，导致IgH/c-Myc 基因易位，极大促进了祖B细胞来源淋巴瘤的发生［8］。越来越多的研究表明，RAG 基因及其蛋白可通过RAG 综合体在某些淋巴瘤的发生中起着重要的作用。

图1 RAG1 和RAG2 蛋白的结构及功能Fig 1 Structure and function of RAG1 and RAG2 protein

2 RAG 蛋白导致淋巴瘤的可能机制

2.1 RAG 综合体直接作用于BCL-2 基因主要断裂区的非一致性DNA 构造

90%的滤泡性淋巴瘤存在14 号和18 号染色体之间的易位:14 号染色体的断裂点位于免疫球蛋白重链区内，故V(D)J 基因正常重组过程也随之停止，18 号染色体上的断裂点则位于BCL-2 基因上的一个150 bp 大小的特定的区域，称作主要断裂区(Major break point region，Mbr)［9］。Mbr 在第18 号染色体上是一个脆弱区域，为一种非一致性DNA 的构造，这个非一致性DNA 的构造在生物体内是RAG 综合体的靶位，很容易被RAG 综合体切断。免疫球蛋白12 和23 信号基因在BCL-2 主要断裂点区域的下游。在免疫球蛋白重链基因V(D)J 重组的过程中，14 号染色体断裂的两条链的任一条链的末端都可以与BCL-2 主要断裂点区域的任一链的末端接合，造成14 号和18 号染色体的易位，此重新聚合的过程完全依赖于DNA 连接酶Ⅳ［9－10］。

随着对细胞凋亡及肿瘤发生机制的深入研究发现，BCL-2 基因的表达与调控是影响细胞凋亡中的关键因素之一。由于染色体t(14:18)(q32:q21)易位，导致BCL-2 基因在细胞内过度表达。BCL-2 蛋白借助其C 末端的疏水区域固定于内质网、线粒体外膜以及细胞核膜上，其N 端的跨膜区则参与抑制细胞凋亡的过程。BCL-2 蛋白抑制线粒体通透性转换孔(permeability transition pore，PTP)开放，阻断细胞色素C 从线粒体释放;可能阻断钙离子从内质网向胞质中流动，使依赖钙离子的核酸内切酶活性降低;亦可通过抗氧化剂或抑制氧自由基的产生［11］，最终抑制细胞凋亡，与滤泡性淋巴瘤的发生密切相关。

2.2 RAG1/2 和AID 协同作用引起染色体易位

目前已知的淋巴细胞成熟过程中双链DNA 断裂(DSB)主要有4 种方式:1)V(D)J 型:在B 淋巴细胞分化早期，其免疫球蛋白链VH(D)JH 基因要实现重组，首先需要RAG 核酸内切酶切割DNA 特定位点的重组信号序列(RSS)［2］。2)类别转换重组(class switch recombination，CSR):活化诱导脱氨酶(activation-induced deaminase，AID)存在于免疫球蛋白基因的体细胞高突变(somatic hypermutation，SHM)和CSR 中，它能作用于Ig 转换区的R 环，导致活化的B 细胞发生DSBs［12］;3)随机型［13］。4)CpG型40% ～70%的祖B/前B 细胞重组区的断裂通过此种形式，特别是靠近BCL-2、BCL-1 和E2A基因的区域［14］。

AID 在次级淋巴器官的生发中心中特异性表达［15］，高度调节正常B 淋巴细胞的发育，生发中心来源的B 细胞非霍杰金淋巴瘤(B-NHL)表达AID，AID 可促进B-NHL 中异常DNA 重排和体细胞超突变［16］。滤泡性淋巴瘤和伯基特淋巴瘤B 细胞分化中，先表达细胞内初始阶段末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)和人类重组激活基因RAG1 与RAG2，进而表达AID，提示RAG可能与AID 相互作用导致淋巴瘤的发生。

研究发现RAG 的靶效应识别位点(off-target recognition)是由AID 经序列修饰后产生的［14］:部分淋巴瘤的断裂点富含CpG 二核苷酸，CpG 的胞嘧啶是甲基化的靶点，甲基化的C 去氨基转变为T，非甲基化的C 去氨基转变为U，但T∶G 错配比U∶G错配更稳定。T∶G错配后产生被RAG 蛋白识别的DNA 结构。故AID 酶可能通过修饰甲基化CpG 序列，引起T∶G错配，从而为RAG 蛋白提供作用位点。但前提是B 细胞同时表达RAG 蛋白和AID 酶，故与CpG 有关的易位多发于祖B/前B 细胞来源的恶性淋巴瘤。发育中的B 细胞也是否同时表达AID 酶和RAG 蛋白有待进一步研究。但值得一提的是，从骨髓中释放出来的B细胞一旦被激活，可再次表达AID 酶和RAG 蛋白［17］，XRCC4 缺失的B 细胞会发生染色体易位:RAG蛋白作用在IgLλ 产生的DSBs 和AID 酶作用在IgH产生的DSBs 相互连接［18］。如果RAG 蛋白在活化的成熟B 细胞中能再次表达，同样会导致AID 酶和RAG 蛋白的共同存在和相互作用。

2.3 RAG2 蛋白降解异常

哺乳动物细胞可通过同源重组(HR)和非同源重组(NHEJ)两种方式修复断裂DNA 双链(DSBs)。V(D)J 的重排是一种由RAG1/RAG2 蛋白复合体介导的NHEJ。RAG 蛋白优先通过经典途径介导V(D)J 的连接，当RAG 突变导致重组能力减弱时，则通过替代途径连接非同源末端(作用很小)或同源末端连接途径［19］。在整个细胞周期中，RAG2 蛋白的含量不是一成不变的，而是在G0和G1时富集，并在G1向S 期转变的过程中被迅速降解。因此，重组中间产物和RAG 信号末端复合物的作用被限制在G0和G1期。G1期向S 期转变时，细胞周期蛋白A-Cdk2会使RAG2 蛋白的苏氨酸490 磷酸化［4］，为泛素连接酶Skp2-SCF 提供结合位点［20］，从而使RAG2 蛋白被蛋白酶体降解。当RAG2 蛋白的苏氨酸490 位点突变为丙氨酸，A-Cdk2 则不能起作用，Skp2-SCF 失去结合位点，此时RAG2(T490A)不仅在G0-G1期起作用，还会使S 期DNA 断裂，而DNA的修复主要依靠HR 途径，容易产生易位。因而Skp2 缺乏，RAG2 蛋白在G1-S 期不能被降解也会导致易位的发生［21］。故RAG2 的致瘤机制可能与其在错误的时间表达，而这些异常和持续存在的RAG2 蛋白会导致V(D)J 的异常重排，加之P53 等抑癌基因的缺失，造成B 细胞异常增生，从而导致淋巴瘤的发生［21］。

2.4 EB 病毒(Epstein-barr virus，EBV)的感染与RAG 的再表达

实验发现在B 细胞表达EB 病毒核抗原-1(EBNA-1)的转基因小鼠易发生淋巴瘤［10］:在表达EBNA-1 小鼠的肿瘤前期样本中BCL-xl 和RAG1、RAG2 基因被诱导表达，但是在EμEBNA-1 的转基因小鼠的肿瘤样本中，RAG 蛋白并没有增高表达。推测RAG 蛋白的表达调控失常增加了基因重组事件发生的概率，进而导致基因的不稳定并最终引起肿瘤的发生。而BCL-xl 的诱导表达可能会是EBNA-1和BCL-2 转基因中高发淋巴瘤的原因。同时BCL-xl 的表达又是IL-2 所引起。故为EBNA-1导致与EBV 相关的肿瘤发生提供线索及潜在的治疗路线［10］。

总之，RAG 基因及其蛋白在淋巴瘤的发病中扮演着重要角色，特别是在滤泡性淋巴瘤中。RAG 基因和淋巴瘤相关性的深入研究，不仅为揭示淋巴瘤的分子发病机制提供依据，也在一定程度上为临床靶向治疗提供线索。

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