张丹丹，万金庆 ，姚志勇，庞文燕，王国强，厉建国

(上海海洋大学食品学院，上海201306)

罗非鱼(Tilapias)原产于非洲，俗称非洲鲫鱼，属鲈形目(Perciformes)丽鲷科(Cichlidae)罗非鱼属(Tilapia)，因其具有适应性强、繁殖率高、生长速度快、抗病能力强、肉多刺少、易于加工等优点，已成为中国养殖水产品中最突出的贸易产品［1-2］。由于其对水温要求相对较高，生存温度范围为15～35℃，在我国广东等温度较高地区养殖规模较大［3］。冰温技术在水产品保鲜的研究在国内报道越来越多，通过对青鱼［4］、牙鲆［5］、草鱼［6］等的研究，冰温贮藏条件更能有效地抑制水产品体内微生物的繁殖，延长食品的贮藏期。冰温贮藏运输不但能保持鱼、肉类食品原有风味，而且可以提高其口感与新鲜度。日本学者在冰温技术中特别强调两个方面，“生物体的防御反应”和恒温技术。为了将生物体防御反应所产生的氨基酸等营养成分的转化达到最大化，必须进行冷却诱导［7］。但不同的生物体冷却诱导的温度与速度也是不同的，这方面的研究报道极少。本实验中采用不同的初始诱导温度对罗非鱼进行了研究，得到最佳的冷诱导初始温度，同时对罗非鱼的鲜度和滋味游离氨基酸进行检测分析，研究在鲜度极好的条件下，滋味游离氨基酸的变化，旨在为罗非鱼冷诱导提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

罗非鱼 2012 年8 月份罗非鱼，采购于上海市临港新城古棕路菜市场，体重500～600g/尾，购买后充氧迅速运回实验室。将活鱼置于保活箱中蓄养1～2h，避免其挣扎，然后将活鱼敲击致死后，片成鱼片，分装入保鲜袋置于冷环境中;三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、肌苷酸(IMP)、次黄嘌呤(Hx) Sigma 公司;一磷酸腺苷(AMP) 日本TCI公司;肌苷(HxR) 德国Dr.Ehrenstorfer 公司;磷酸氢二钾、磷酸二氢钾 上海安谱科学仪器公司，色谱纯;超纯水、高氯酸(PCA)、氢氧化钾、氢氧化钠、磷酸、磺基水杨酸 国药集团化学试剂有限公司，分析纯;甲醇 国药集团化学试剂有限公司，色谱纯。

LC-2010CHT 高效液相色谱仪、AUW320 电子天平 日本岛津公司;L-8800 氨基酸全自动分析仪 HITACHI 公司;Agilent-34972A 温度采集仪 安捷伦公司;BPS-250CB(-20～100℃)恒温恒湿箱、DHG-9053A 电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;IMS-50 全自动雪花制冰机 常熟雪科有限公司;SB25-12DT 超声机 宁波新芝生物科技;FA25均质机 Fluko 公司;PHS-3C 型pH 计 上海精密科学仪器有限公司;H2050R 冷冻离心机 长沙湘仪有限公司;GM-0.33A 隔膜真空泵及溶剂过滤器 天津市津腾实验设备有限公司;Haier BCD-216SCM 冰箱 青岛海尔公司。实验用的器材均采用超声机清洗20min，用蒸馏水反复冲洗，然后用超纯水润洗2～3遍，烘干机烘干备用。

1.2 实验方法

1.2.1 冰点的测定 沿脊椎把鱼剖为两片，将热电偶插入鱼体表下约0.5cm 处并固定，放入-20℃的冻藏室，温度采集间隔为10s 采集一次数据，实验结束后绘制冻结曲线并得出罗非鱼冰点。

1.2.2 不同冷诱导初始温度的冷诱导方式降温程序的设定 5 种不同的初始温度，分别为25、20、15、10、5℃，均采用温控降温。降温程序见表1。

表1 降温程序的设置Table 1 Cooling program sitting

以同样的降温速率降温，让鱼肉缓慢的适应冷环境，直至降至冰温带，并维持冰温条件一段时间。

1.2.3ATP 及其关联化合物的检测 参考Yokoyama［8］的方法，略有改动。鱼片ATP 及关联化合物的提取:取新鲜鱼片和经过冷处理后的样品，快速切碎后取5g 放入离心管中，加入预冷的10mL 10%的高氯酸(PCA)溶液打浆2min。匀浆后用10000r/min 冷冻离心15min，取上清液。沉淀用预冷的5% PCA 洗涤，离心取上清液，重复操作一次。合并上清液，先用10mol/L 的KOH 溶液调节pH，待接近所需pH 时，改用1mol/L 的KOH 溶液精调pH 为6.5，静置30min 后将上清液转移至50mL 容量瓶中，并用超纯水定容，摇匀，用0.45μm 微孔过滤膜过滤后等待测定。整个过程均在0～4℃条件下操作。

高效液相色谱(HPLC)检测色谱条件:GL Sciences 公司Inertsil ODS-SP C18(4.6mm ×250mm，5μm)液相色谱柱;保护柱柱芯Inertsil ODS-SP(4mm×10mm，5μm);流动相:A 为0.05mol/L 磷酸二氢钾和磷酸氢二钾(1∶1)溶液，用磷酸调至pH6.5，B 为甲醇溶液;等度洗脱;流速:1mL/min;柱温:28℃;进样量:10μL;检验波长:254nm。

鲜度指标K 值是反映水产品初期鲜度变化以及风味有关的生化指标。Saito［9］等人提出以ATP 及其相关化合物作为评定鱼类鲜度指标以来，许多学者通过沙丁鱼［10］、海鳗［11］、大黄鱼［12］等水产品研究K值与鲜度之间的关系，K 值是一种公认的评价鱼早期鲜度的指标，即杀鱼的K 值在10%以下。K 值越小表示鲜度越好，K 值越大则鲜度越差。作为生食鱼片的K 值在一级鲜度20%以下，20%～40%为二级鲜度，60%～80%为初期腐败鱼。鱼肌肉中ATP 按ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx 途径降解，其中HxR+Hx 与ATP 及其降解产物总和的比值，即为K值，可用下式表示:

1.2.4 游离氨基酸的检测 参考邓捷春［13］的游离氨基酸测定方法，略有改动。游离氨基酸的提取:分别称取鱼肉2g，加入10mL 5%(w/v)磺基水杨酸，沉淀2h使蛋白质沉淀下来，吸取6mL 上清液用10000r/min冷冻离心机离心15min，取3mL 上清液，用一定量NaOH 溶液调节pH 至2.0 左右，定容至12mL，用0.45μm 微孔过滤后装至样品盘中上机测定。

分析条件:L-8800 型氨基酸自动分析仪，样品分析周期53min。色谱柱(4.6mm ×150mm，7μm);柱温:50℃;通道1 流速:0.4mL/min，通道2 流速:0.35mL/min。流动相:pH 分别为3.3、3.2、4.0、4.9 的柠檬酸和柠檬酸钠混合缓冲液和浓度为4%茚三酮的缓冲液。

2 结果与讨论

2.1 冰点的测定

罗非鱼的冻结曲线如图1 所示。数据显示罗非鱼的冻结点在-1.2℃左右，因此可以认为当罗非鱼片的贮藏温度降至冰点后再持续下降时，鱼片细胞内开始结晶，破坏细胞结构。根据测得的罗非鱼片的冰点，本文实验是将罗非鱼片降至冰温带后，鱼片温度定位在(-0.5 ±0.3)℃范围内保持不变。

图1 罗非鱼冻结曲线Fig.1 Freezing curve of Tilapia

2.2 鱼片温度的变化

罗非鱼鱼片前35h 降温曲线如图2 所示。结果表明:方式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ降温曲线均呈连续降温趋势，并分别在27、22、17、12、7h 左右到达冰温带，并维持在冰温带一段时间，保持罗非鱼鱼片温度在(-0.5 ±0.3)℃。

图2 罗非鱼鱼片的温度变化Fig.2 Temperature change of Tilapia fillets

2.3 鲜度指标K 值的变化

通过计算，在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ5 种初始温度不同的冷诱导方式下，罗非鱼K 值的变化如图3 所示。

图3 不同的初始温度冷诱导条件下罗非鱼片K 值变化Fig.3 K value of Tilapia fillets with different initial temperature cold-induction modes

由图3 可以看出，5 种不同初始温度的冷诱导方式，对罗非鱼鱼片K 值的影响，K 值在降温过程中，随贮藏时间变长，均呈上升趋势，新鲜鱼片的K 值为2.27%。方式Ⅰ和ⅡK 值上升较快，方式Ⅲ次之，方式Ⅳ和Ⅴ增长缓慢，呈平缓上升趋势。方式Ⅰ诱导27h 后，K 值刚到20%，还在一级鲜度范围内;在28～70h 后K 值超过40%，鱼片处于二级鲜度阶段;在171h K 值为46.1%，还未到腐败阶段。方式Ⅱ在30h处，超过一级鲜度指标20%，在70～142h 处K 值均超过30%，且在142h 接近二级鲜度指标。方式Ⅲ在50h 仍处于一级鲜度指标范围内，直到161h，K 值36.7%，在二级鲜度指标范围内。方式Ⅳ和方式Ⅴ，分别在108 和127h 到达一级鲜度指标，到150h 未超过30%，维持在较高的鲜度水平。

2.4 核苷酸IMP 及ATP 分析

肌苷酸(IMP)由三磷酸腺苷(ATP)降解而来，是核苷酸类的主要呈味物质，已广泛地应用于食品调味中。IMP 是一种鲜味极强的风味增强剂［14］，随着ATP 的分解，IMP 呈上升的趋势，一般来说1～2d 之内达到最高浓度，并维持一段时间，这与实验结果相一致。ATP 的快速降解与高活性的ATP 酶有关，Wataba 等［15］认为，在低温下肌浆网状结构的钙吸收能力下降，肌原纤维内钙浓度增加，钙离子激活肌原纤维Mg2+-ATP 酶，加速了ATP 的降解。由图4 可知，在40h 之内，IMP 均出现峰值，40h 之后以不同速度降解，方式Ⅰ和方式Ⅱ的降解速度较快，在50h 处低于刚宰杀时IMP 值。方式Ⅲ、Ⅳ低于刚宰杀时IMP 值2.62μmol/g，时间分别为89、150h。方式Ⅴ的IMP 含量一直处于较高水平，实验结束仍高于刚宰杀的水平。

图4 不同初始温度冷诱导条件下罗非鱼IMP 和ATP 的变化Fig.4 IMP and ATP of tilapia fillets with different initial temperature cold-induction modes

2.5 游离氨基酸的分析

表2 列出了罗非鱼6 种滋味游离氨基酸及游离氨基酸总量的变化情况。就TFAA 而言，方式Ⅰ、Ⅱ均增势平缓，方式Ⅲ、Ⅳ有比较明显的增加，方式Ⅴ增长速度最慢。与鱼宰杀后的0h 比较，在27h 处，分别增加了10.81%，10.31%，21.46%，14.87%，4.97%;在75h 处，分别增加了15.55%、13.31%、32.01%、15.01%、8.71%;在123h 处，分别增加了16.43%、19.19%、32.63%、25.36%、14.91%。以上5 种不同初始温度的冷诱导方式TFAA 含量，均呈上升趋势，方式Ⅲ、Ⅳ增势明显，均高于方式Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ。鱼肉的鲜美味道主要是由甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸等氨基酸决定，实验结果表明，在刚宰杀的罗非鱼片中，天门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸这4 种主要的呈味游离氨基酸就占了测得的TFAA 的57.28%，这些成分对鱼肉滋味的影响是非常明显的。

鱼类游离氨基酸与贝类相比含量较低，但是某些游离氨基酸能够以足量高的浓度存在于鱼肉中，对鱼的风味产生作用。在罗非鱼鱼片的呈味游离氨基酸中，甘氨酸和丙氨酸含量相对较高，其中甘氨酸是海鲜产品的主要呈味物质，跟鲜味物质肌苷酸、谷氨酸等有相乘作用［16］。5 种不同初始温度的冷诱导方法，在27h 处比较，方式Ⅲ的甘氨酸含量最高，接近甘氨酸的阈值 130mg/100g，比原样增加了34.18%，方式Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ分别增加了20.98%、18.65%、28.10%，方式Ⅴ增势最小。鱼贝类都含有谷氨酸，鱼肉中的谷氨酸的阈值在0.03%以下，但是与死后肌肉中的肌苷酸产生相乘作用，所以即使含量在阈值以仍能产生鲜味［17］。与谷氨酸的5 种降温方式，在27h 处基本都超过阈值5mg/100g，比原样的增加量分别为16.04%、20.37%、23.12%、23.74%、2.89%。在75h 处的增加量分别为5.74%、30.30%、37.07%、18.65%、10.53%，方式Ⅲ谷氨酸增势相对明显。丙氨酸是甜味氨基酸，对鱼肉的鲜味有贡献［18］。5 种方式中丙氨酸的含量在21mg/100g 上下浮动，变化比较平缓。组氨酸是造成某些海产品肉香的特质［18］，方式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ增加比较显著，在27h 处比0h 处增加了69.41%、44.50%、95.22%，方式Ⅳ、Ⅴ基本没有增长变化。

表2 罗非鱼片滋味游离氨基酸组成(mg/100g)Table 2 Composition of free amino acid of tilapia fillets(mg/100g)

亮氨酸和异亮氨酸是呈苦味的氨基酸，研究结果发现亮氨酸和蛋氨酸的含量远低于它们的阈值190 和90mg/100g，并且在降温过程中有减少趋势。除此之外，精氨酸含量和蛋氨酸也是苦味氨基酸，精氨酸对口感的持续性和复杂性有不容忽视的作用，蛋氨酸是海胆风味不可或缺的呈味成分［18］。

3 结论

3.1 冷诱导方式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，对罗非鱼鲜度影响是不同的。初始诱导温度越低，K 值的增长越缓慢，鲜度越好，反之K 值增长较快，鲜度下降。

3.2 冷诱导方式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，IMP 含量均在40h 内出现峰值，于此同时ATP 迅速降解。

3.3 冷诱导方式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，游离氨基酸总量均有所增加，不同的诱导方式增幅程度不同，研究发现冷诱导初始温度为15℃，游离氨基酸增加量比较显著。

［1］汪之和，施文正.罗非鱼鱼糜的加工特性［J］.科学养鱼，2003(3):56-57.

［2］陈晓眠，吴晓萍，邓楚津，等.壳聚糖和茶多酚对罗非鱼冷藏保鲜效果比较［J］.现代食品科技，2011(3):279-282.

［3］王术娥，李小定，熊善柏，等.湖北罗非鱼营养及挥发性成分分析与评价［J］.食品科技，2010(11):160-164.

［4］梁琼，万金庆，王国强.青鱼片冰温贮藏研究［J］.食品科学，2010(6):270-273.

［5］李辉，刘莲风，杨博峰，等.冰温保鲜条件下牙鲆的鲜度及质构变化［J］.渔业科技进展，2011(6):63-66.

［6］龚婷，熊善柏，陈家平，等.冰温气调保鲜草鱼片加工过程中的减菌化处理［J］.华中农业大学学报，2009，28(1):111-115.

［7］服部國彦.提高食品新鲜度及口味的冰温技术［C］.第3届中国食品冷藏链新设备新技术论坛论文集.天津:中国制冷空调工业协会，2007，10:66-71.

［8］Yokoyama Y，Sakaguchi M，Kawai F，et al. Change in concentration of ATP- related compounds in varioustissues of oyster during ice storage［J］.Nippon Suisan Gakkaishi，1992，58(11):2125-2136.

［9］邓捷春，王锡昌，刘源.暗纹东方鲀与红鳍东方鲀滋味成分差异研究［J］.食品工业科技，2010，31(3):106-108.

［10］SaitoT，Arar K，Matuyoshi M.A new method for estimating the freshness of fish［J］.Bull Jap Sci Soc Fish，1959，24(9):749-750.

［11］FAVa'zquez-Ortiz，RPacheco-Aguilar，MELugo-Sanchez，et al.Application of the Freshness Quality Index(K Value)for Fresh Fish to Canned Sardines from Northwestern Mexico［J］.JOURNAL OF FOOD COMPOSITION AND ANALYSIS，1997 (10):158-165.

［12］Yesim Özogul，Fatih Özogul，Cengiz Gökbulut. Quality assessment of wild European eel stored in ice ［J］.Food Chemistry，2006，95(3):458-465.

［13］杨文鸽，薛长湖，徐大伦，等.大黄鱼冰藏期间ATP 关联物含量变化及其鲜度评价［J］.农业工程学报，2007(6):217-222.

［14］戚晓玉，李燕，周培根.日本沼虾冰藏期间ATP 降解产物变化及鲜度评价［J］.水产学报，2001(5):482-484.

［15］Watabe S，Ushio H，Iwamoto M，et al. Temperature -dependency of rigor-mort is of fish muscle:myofibrillar Mg2+-ATPase activity and Ca2+uptake by sarcoplasmic reticulum［J］.J Food Sci，1989，54:1107-1115.

［16］翁世兵，孙恢礼.海产鲜味物质及海产品特征滋味的研究进展［J］.中国调味品，2007(11):21-27.

［17］杨晋，陶宁萍，王锡昌.文蛤的营养成分及其对风味的影响［J］.中国食品与营养，2007(5):43-45.

［18］须山三千三，鸿巢章二.水产食品学［M］.吴清熊，邱思魁译.上海:上海科技出版杜，1987:1-11，125-129.