马丽苹，秦翠丽，邱智军，尤晓颜，曾晓雄

(1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳471023;2.南京农业大学食品科技学院，江苏南京210095)

低聚糖又称寡糖，是由2～10 个单糖通过糖苷键连接形成直链或支链的低度聚合糖，按照其能否被人体胃酸和胃酶所降解，并对人体有无特殊的生理功能可分为普通低聚糖和功能性低聚糖。普通低聚糖包括蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖和麦芽三糖等，它们可被机体胃肠内的消化酶所水解并消化吸收，主要作用是提供人体活动所需的能量和赋予食品怡人的甜味［1］。功能性低聚糖包括低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、低聚果糖、低聚半乳糖、壳低聚糖、低聚木糖等，因其单糖分子间结合位置比较特殊，在人体肠道内不具备相应的分解消化的酶系统，不能被人体胃酸和胃酶所降解，在小肠内不能被消化吸收，而是直接进入大肠主要被有益菌双歧杆菌所利用，发挥众多 的 生 理 功 能［2-3］。α - 低 聚 半 乳 糖(α -Galactooligosaccharides，α-GOS)是功能性低聚糖的一种，它是一类含有α-半乳糖苷键的低分子量可溶性低聚糖，其主要的获取途径是从大豆、羽扇豆和鹰嘴豆等豆科植物中提取［4-5］。目前市场上的α-GOS产品主要是大豆低聚糖，其主要成分是蔗糖、棉籽糖和水苏糖，且已被应用于饮料、酸奶、保健食品等领域。银条(Stachys floridana Schuttl.ex Benth)是唇形科水苏属多年生宿根草本植物，其根状茎呈圆柱形且细长，肉质洁白，酷似白银，主产于华北、华南和新疆等地，多处于半野生状态。作为蔬菜，人工栽培主要集中在河南偃师，占全国栽培总量的95%以上［6］。据偃师县志记载，自唐代以来，银条就已作为历代宫廷贡品。银条富含碳水化合物、多酚、VC、蛋白质和有机酸，具有降血脂、软化血管和改善血液循环的作用［7］。最近钟先锋等研究发现银条中含有蔗糖、棉籽糖和水苏糖等α-低聚半乳糖［8］，且已有研究发现功能性低聚糖具有提高机体免疫能力的活性［9-12］，但关于银条α-低聚半乳糖的免疫调节活性至今尚未见到有关报道。因此，本研究拟采用环磷酰胺(CTX)免疫抑制小鼠模型评价银条α-GOS 的免疫调节活性，为银条α-GOS 生理功能的阐明及综合利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

银条 2009 年12 月购于偃师市农贸市场，用去离子水清洗干净，50℃烘干后，粉碎过60 目筛，保存在自封袋中备用;注射用CTX 江苏恒瑞制药有限公司;盐酸左旋咪唑 济南奥德凯药业有限公司;二硝基氟苯 成都西亚试剂有限公司;溶菌酶、BCA-100 蛋白质定量检测试剂盒 南京建成生物工程研究所;蔗糖 瑞士Fluka 公司;棉籽糖 德国Merck公司;水苏糖 美国Sigma 公司。

HH-4 型数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司;TDL-5 型台式离心机 上海安亭科学仪器厂;Laborota-400 型旋转蒸发器 德国Heidolph 公司;SHB-Ⅲ型循环水式真空泵 郑州长城科工贸有限公司;DHG-9140A 型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司;TYL-350 型组织匀浆机 山东九阳小家电有限公司;D-101 大孔吸附树脂 江苏九天树脂科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 银条α-GOS 的提取及初步纯化 将100g 银条干粉按15∶1 液料比用60%乙醇在50℃条件下浸提2 次，每次40min，然后合并乙醇提取液，50℃真空浓缩至干，用蒸馏水复溶后冻干。然后将银条低聚糖冻干样配成浓度为20mg/mL 的水溶液，上样于D-101大孔吸附树脂，用去离子水以1mL/min 的速度进行线性洗脱，采用硫酸-苯酚法隔管检测洗脱液中的总糖含量，合并相同组分，50℃旋转蒸发浓缩，真空冷冻干燥，得初步纯化样品31.54g，故银条α-GOS的得率为31.54%。

1.2.2 银条α-GOS 含量的测定 采用高效液相色谱外标法测定样品中的低聚糖含量。

糖标准曲线的制备:准确称取蔗糖、棉籽糖、水苏糖的标准样品，用水溶解后，加入等量的乙腈，配制成一系列不同浓度梯度的标准溶液，经0.45μm 针头式有机系滤膜过滤后，按浓度从低到高的顺序进行HPLC 检测，得到各个糖的保留时间，并记录各个浓度对应的峰面积，以峰面积对浓度作图，得到各个糖的标准曲线。蔗糖、棉籽糖、水苏糖标准曲线分别为:y = 300106x-59887，R2= 0.9999;y = 231018x-79765，R2=0.9998;y =162331x +84737，R2=0.9996。其中y 代表各标准糖峰面积，x 代表糖浓度(mg/mL)。

对提取得的银条α-GOS 进行HPLC 分析，色谱柱:Hypersil 氨基柱，4.6 ×250mm，内径5μm;检测器:RID;柱温:40℃;流动相:乙腈∶水=70∶30(v/v);流速:1.0mL/min;进样量:20μL。标准曲线HPLC 分析条件同上。

1.2.3 银条α-GOS 对免疫抑制小鼠的免疫调节活性

1.2.3.1 动物分组及实验设计 选取6 周龄、体重(BW)(18 ±2)g ICR 雌性小白鼠适应性饲养5d 后，随机分成6 组，每组8 只。空白组:每天1 次腹腔注射生理盐水0.5mL，共8d;模型组:每天1 次腹腔注射生理盐水0.5mL，共8d，实验的第2、3、4d，在注射生理盐水10h 后，按剂量100mg/kg BW 腹腔CTX 一次;阳性组:每天1 次腹腔注射盐酸左旋咪唑7mg/kg，共8d。

低剂量组、中剂量组和高剂量组，每天腹腔注射剂量分别为50、100、200mg/kg BW 的银条α-GOS 样品1 次，实验的第2、3、4d，在注射银条α-GOS 样品后10h 后，按剂量100mg/kg BW 腹腔注射CTX 一次，共8d。末次给药12h 后，颈椎脱臼法处死小鼠，测定脾指数、胸腺指数、迟发型变态反应和血清中溶菌酶活性。

1.2.3.2 银条α-GOS 对免疫抑制小鼠免疫器官的影响 小鼠处死后解剖并摘取脾脏、胸腺，用生理盐水洗去血渍，用滤纸吸去表面水分后称重，脾脏称重后立即置于冰上，待后期处理。按以下公式计算脏器指数:

脏器指数(mg/g)=W1/W0

式中:W0为小鼠体重(g)，W1为脏器重量(mg)。

1.2.3.3 银条α-GOS 对小鼠迟发型超敏反应(DTH)的影响［13］在给药的第3d，小鼠腹部剪去小块毛发，面积约3cm×3cm，将小鼠腹部朝上平放，用移液枪吸取1%二硝基氟苯30μL(丙酮与植物油1∶1 配比后配制二硝基氟苯溶液)分两次缓慢滴加至去毛部位，待药物被腹部皮肤吸收后，将小鼠放回鼠笼。在给药后第7d 晚上，用1%二硝基氟苯20μL 均匀涂擦小鼠右耳两侧，左耳不擦作为对照。末次给药后12h，将小鼠脱颈椎处死后，用打孔器将左右耳片分别打孔(直径6mm)，取圆形耳片称重，计算耳肿胀度。

耳肿胀度(%)=(W1-W0)/W0×100

其中:W0为左耳重量(g)，W1为右耳重量(g)。

1.2.3.4 银条α-GOS 对小鼠血清中溶菌酶的影响 用试剂盒测定血清中溶菌酶含量，具体操作按说明书进行。

2 结果与讨论

2.1 银条α-GOS 的制备及其含量测定

根据不同糖标准曲线的回归方程，计算得出本实验提取得到的银条α-GOS 含量。本实验选用的银条其α-GOS 主要有蔗糖、棉籽糖、水苏糖等组成见图1～图2。其中水苏糖含量最高，约占可溶性总糖的65.72%;其次是蔗糖，约占总糖的5.68%;最后是棉籽糖，约占4.99%。从结果可以看出，银条α-GOS的含量为76.39%，银条中主要的α-GOS 是水苏糖，其含量约占总α-GOS 含量的86.03%。

2.2 银条α-GOS 的免疫调节作用

2.2.1 银条α- GOS 对小鼠免疫器官指数的影响 银条α-GOS 对小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响见表1。与空白组相比，CTX 模型组的脾脏指数和胸腺指数均显著降低(p ＜0.05)，说明CTX 免疫抑制模型建模成功。与CTX 模型组相比，不同剂量的银条α-GOS均能显著的提高CTX 免疫抑制小鼠的脾脏指数(p ＜0.05)，尤其在中、高剂量范围时，CTX 免疫抑制小鼠的脾脏指数比正常小鼠的脾脏指数还高，说明银条α-GOS 能够使因CTX 诱导产生的脾脏指数下降得以恢复，在一定程度上提高了机体的免疫力。然而，与模型组相比，不同剂量的银条α-GOS 均不能使CTX 引起的小鼠胸腺指数下降得以恢复，究其原因，就目前所掌握的资料尚未看到有明确合理的解释，因此有待下一步深入研究。胸腺和脾脏是机体主要的外周免疫器官，它们的重量从一定程度上反映了免疫器官内淋巴细胞的数量，从而间接了解体内淋巴细胞总体水平。而免疫器官指数不仅能很好的反映机体免疫器官的重量变化，且能将个体差异的影响降到最低限度［14］。所以，一般免疫药理学实验常以其作为反映机体免疫功能的最常规的指标［15］。本研究结果表明银条α-GOS 能够提高CTX免疫抑制小鼠的脾脏指数，因此在一定程度上提高了小鼠的免疫能力。

图1 标准糖的HPLC 图谱Fig.1 HPLC chromatography of standard sugar

图2 银条α-GOS 的HPLC 图谱Fig.2 HPLC chromatography of α-GOS from S.floridana Schuttl.ex Benth

2.2.2 银条α-GOS 对小鼠DTH 的影响 银条α-GOS对小鼠DTH 的耳肿胀度的影响列于表1 中。从表1 中可以看出，CTX 模型组与空白组相比，耳肿胀度显著减少(p ＜0.05)，说明CTX 免疫抑制模型建模成功。而阳性药物和不同浓度的银条α-GOS 处理均显著地提高DTH 的耳肿胀度(p ＜0.05)，且这种变化与银条α-GOS 呈现剂量依赖关系。实验结果表明银条α-GOS 可以使因CTX 诱导产生的DTH 的耳肿胀度下降得以恢复。DTH 是由效应T 细胞与相应抗原作用后，引起的以单个核浸润和组织细胞损伤坏死为主要特征的炎症反应，是细胞免疫反应的一种特殊表现，是检测细胞免疫功能的常用方法之一。二硝基氟苯是一种半抗原，将其稀释液涂抹于皮肤后，可与皮肤蛋白结合成完全抗原，由此刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞，4～7d 后再将其涂抹于耳部进行抗原攻击，局部可产生DTH 而出现肿胀。一般抗原攻击后24～48h 达到高峰，测定其肿胀程度可以反映出DTH 程度［16］。本实验结果表明银条α-GOS能够提高免疫抑制小鼠的耳肿胀度，因此在一定程度上表明银条α-GOS 具有提高免疫抑制小鼠T 淋巴细胞免疫水平的能力。

表1 银条α-GOS 对小鼠脾脏指数，胸腺指数和耳肿胀度的影响Table 1 Effects of α-GOS from Stachys floridana Schuttl.ex Benth on spleen index，thymus index and swelling rate of ear

2.2.3 银条α-GOS 对小鼠血清中溶菌酶活性的影响 银条α-GOS 对小鼠血清中溶菌酶活性的影响如图3。从图3 中可以看出，与空白组相比，CTX 模型组血清中的溶菌酶含量显著降低(p ＜0.05)，表明CTX 免疫抑制模型建模成功。小鼠腹腔注射中、高剂量的银条α-GOS 后，与空白组和模型组的小鼠相比，其血清中的溶菌酶含量极显著上升，且这种变化与剂量呈现一定的量效关系，即溶菌酶活性随剂量的上升而上升，在剂量为200mg/kg BW 时达到最高值(653.33 ±47.94)U/mL。该实验结果表明，腹腔注射银条α-GOS 可以显著地提高免疫抑制小鼠血清中溶菌酶活性，使其中溶菌酶活性恢复并超过正常水平。溶菌酶(Iysozyme)又称胞壁酶(muramidase)或 N - 乙酰胞壁质聚糖水解酶 (N -acetylmuramideglycanohydrase)，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。溶菌酶广泛存在于鸟类、家禽的蛋清中和哺乳动物的泪液、唾液、血浆、乳汁、胎盘、体液以及组织细胞内，其中蛋清中的含量最丰富(约0.3%)［17］。溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒、抗肿瘤和增强机体免疫力等作用［18］，因此在机体的正常防御功能和非特异性免疫中，占有重要地位。因此，本实验结果说明银条α-GOS 可以在体内通过提高溶菌酶活性而提高机体的非特异免疫能力。

图3 银条α-GOS 对小鼠血清中溶菌酶活性的影响Fig.3 Effect of α-GOS from Stachys floridana Schuttl.ex Benth on the activity of lysozyme in mice serum

3 结论

以银条为原料，制备得主要由蔗糖、棉籽糖和水苏糖组成的银条α-GOS，含量为76.39%，其中水苏糖约占总α-GOS 的86.03%。免疫调节作用研究结果表明:银条α-GOS 可以显著地提高CTX 免疫抑制小鼠的脾脏指数、DTH 的耳肿胀度和血清中溶菌酶的活性，表明银条α-GOS 具有一定的免疫调节能力。

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