李彩霞，高海宁，马 佩，崔 玮，吴冬青，张 勇，*

(1.河西学院农业与生物技术学院，甘肃张掖734000;2.甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室，甘肃张掖734000;3.河西学院化学化工学院，甘肃张掖734000)

花青素是一类天然存在的酚类成分，广泛分布在水果、豆类、谷物和蔬菜中。许多研究表明，花青素有许多潜在的生物活性和药学功能，如抗氧化［1］、抗动脉粥样硬化［2］、抗炎症［3-4］等。“黑美人”土豆是兰州陇神公司通过航天育种选育的新品种，其秧苗是黑紫色，块茎表皮呈黑色，肉呈紫色，富含多种营养型微量元素。其黑紫色是富含具有抗癌［5］、抗氧化［6］、和防止高血压等多种保健作用的花青素。目前对黑美人土豆的研究主要在引种栽培［7］和色素稳定性［8］及纯化分离［9］方面的报道，而对其色素在机体内生理活性研究报道较少。基于此，本研究以“黑美人”土豆为材料，对其花色素苷进行分离纯化，探讨花色素苷对D-半乳糖诱导昆明衰老小鼠血清中SOD 酶活性、总胆固醇和甘油三酯以及脑、肝组织中抗氧化酶活性的影响，进而评价“黑美人”土豆花色素苷对小鼠体内的抗氧化作用，为进一步开发“黑美人”土豆活性成分提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

“黑美人”土豆 购于民乐县新天铺，清洗泥土，冷冻备用。

谷胱甘肽过氧化氢酶(GSH-PX)测试盒、总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒、丙二醛(MDA)测试盒 购自南京建成生物工程研究所;甘油三脂试剂盒、总胆固醇试剂盒-CHO(酶法)(干粉) 北京北化康泰临床试剂有限公司;D-半乳糖 购于sigma 公司;95%乙醇，盐酸，NaCl 等试剂均为国产分析纯;AB 大孔吸附树脂 天津南开大学化工厂产品。

健康昆明种小鼠，体质量(32 ±2)g，共40 只，雌雄各半，随机分为对照组、D-半乳糖衰老模型和花色苷处理(低、中、高剂量组)5 组，实验动物由兰州大学实验动物中心提供，动物合格证号:甘医动字第14-006。

多功能食品加工机 广东洛贝电子科技有限公司;旋转蒸发器RE-2000A、DHZ-D(Ⅲ)循环水真空泵 巩义市京华仪器有限责任公司;调温型电热套(MH-1000) 北京科伟永兴仪器有限公司;AE200电子天平 Mettler Toledo 公司;CR21GⅡ高速冷冻离心机 日立公司;752N 紫外分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;LGJ-18 冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司;pro200 组织匀浆器 美国Pro Scientific 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 “黑美人”土豆花色素苷的提取与纯化 “黑美人”土豆花色素苷的提取分离与纯化根据文献［9］操作:将洗脱收集的色素液在30～40℃减压浓缩回收乙醇，“黑美人”土豆花色素苷浓缩液，冷冻干燥得到紫黑色粉末。最后用生理盐水配制成低、中、高浓度色素液进行灌胃。

1.2.2 动物分组与D-半乳糖诱导衰老模型的建立 昆明小鼠40 只随机分为5 组，即对照组，衰老模型和低、中、高花色苷剂量实验组，每组8 只，雌雄各半，花色苷组每天灌胃剂量为，低剂量组50mg/kg·bw、中剂量组100mg/kg·bw 和高剂量组200mg/kg·bw 的溶液，其中，模型组和色素剂量组均颈背皮下注射100mg/kg·bw D-半乳糖;对照组颈背皮下注射等体积的生理盐水，模型组和对照组并灌胃等体积的生理盐水，每天1 次，连续注射1 个月，并根据小鼠体重调整灌胃量，灌胃期间自由取食和饮水。实验结束时称量鼠的体重，并取各组小鼠摘除眼球采血分离血清，颈椎脱臼法处死动物，分离脑、肝脏-20℃保存备用。测定血清中SOD 酶活性、总胆固醇、甘油三酯及各脏器匀浆中T-AOC、SOD 酶活性和MDA 含量。

1.2.3 指标测定 总抗氧化能力(T-AOC)、总胆固醇-CHO(酶)含量、谷胱甘肽过氧化氢酶(GSH-PX)测试盒、脂质过氧化物(MDA)含量，测定方法严格按照试剂盒说明书进行操作，用分光光度法测定;超氧化物歧化酶(SOD)活性采用NBT 还原法测定［10］;组织蛋白含量采用Bradford 法测定［11］。

1.2.4 数据分析 实验结果用平均值加标准误表示，采用SPSS 13.0 统计软件进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 “黑美人”土豆色素对小鼠体重的影响

由表1 可知，与处理前相比，处理后对照组小鼠体质量有上升趋势;模型组明显呈下降趋势;花色苷处理组呈上升趋势，其中，高剂量组上升趋势较为明显;从处理前后鼠重变化值来看，模型组与对照组差异显著(p ＜0.05)，同时模型组小鼠反应迟钝，毛发稀疏无光泽，在雄性小鼠中表现更为明显。以上结果表明本实验用D-半乳糖诱导的小鼠动物模型基本成功。

表1 “黑美人”土豆色素对小鼠体重的影响Table 1 The effect of BBPA on mice weight

2.2 “黑美人”土豆色素对小鼠血清SOD 酶活性、TC 和TG 的影响

由表2 可知，与对照相比，模型组小鼠血清中SOD 酶活性显著降低，甘油三酯显著升高(p ＜0.05)，而总胆固醇差异不显著，花色素苷处理组与模型组相比较，SOD 酶活性明显增高，TG 和TC 随着花色苷剂量的增加呈下降趋势，但与模型组无显著差异。

2.3 “黑美人”土豆色素对小鼠肝脏T-AOC、GSH-Px、SOD 酶活力和MDA 含量的影响

由表3 可知，与模型组相比，不同剂量“黑美人”土豆色素处理组小鼠肝脏中T-AOC、SOD、GSH-PX酶活性呈上升趋势，其中高、中剂量组GSH-Px 酶与模型组差异显著(p ＜0.05)，MDA 含量呈降低趋势，差异显著(p ＜0.05)，但不同剂量处理组间MDA 含量差异性不显著。

2.4 “黑美人”土豆色素对小鼠脑组织T-AOC、SOD、GSH-Px 酶活力和MDA 含量的影响

由表4 可知，与对照组相比，模型组小鼠脑组织T-AOC、SOD、GSH-Px 酶活性均呈下降趋势，其中，GSH-Px 酶活力差异显著(p ＜0.05)，MDA 含量升高，但差异不显著;与模型组相比，“黑美人”土豆色素低、中、高剂量组小鼠脑组织T-AOC、SOD、GSH-PX 酶活性随色素浓度呈上升趋势，T-AOC、SOD、GSH-Px 酶活性色素高剂量处理组差异显著(p ＜0.05)，模型组MDA 含量明显高于处理，但不同剂量组间MDA 含量差异不显著。

表2 “黑美人”土豆色素对小鼠血清SOD 酶活性、TC 和TG 的影响Table 2 The effect of BBPA on the activities of SOD，TC and TG in mice serum

表3 “黑美人”土豆色素对小鼠肝脏T-AOC、SOD、GSH-Px 酶活力和MDA 含量的影响Table 3 The effect of BBPA on the activities of T-AOC，SOD，GSH-Px and MDA content in mice liver

表4 “黑美人”土豆色素对小鼠脑T-AOC、SOD、GSH-Px 酶活力和MDA 含量的影响Table 4 The effect of BBPA on the activities of T-AOC，SOD，GSH-Px and MDA content in mice brain

3 讨论与结论

亚急性衰老模型机制是指在一定时间内，连续给动物注射大剂量的D-半乳糖，使机体细胞内半乳糖浓度增高，在醛糖还原酶催化下，还原成半乳糖醇，这种物质不能被细胞进一步代谢，而堆积在细胞内，影响正常渗透压，导致细胞肿胀，功能障碍，代谢紊乱，最终导致衰老的发生［12］。研究发现，黑米花色苷、蓝莓花色苷和蓝靛果花色苷可以促进TC 的逆向转运，提高了血浆中高密度脂蛋白水平，增加了肝脏对胆固醇的摄取和代谢［13-14］。本实验研究发现，注入D-半乳糖诱导的小鼠血清中TG、TC 升高，当给予“黑美人”土豆色素后，血清中TG、TC 缓慢降低，TC差异不显著(p ＞0.05)。由此说明，“黑美人”土豆色素对恢复D-半乳糖诱导衰老模型小鼠血清血脂水平具有一定的作用。

SOD 是存在于细胞液中的抗氧化酶，其活性高低间接反映了机体清除自由基的能力［15］。与模型组相比较，不同剂量处理组小鼠血清、肝脏和脑中SOD酶活性均有不同程度的提高，在这些指标变化中，对脑组织中提高最为明显。GSH-Px 是机体广泛存在的催化过氧化氢或过氧化物的重要酶类，机体类GSH-Px 的下降，可使脂质过氧化产物增多而致衰老［16］。本结果显示，“黑美人”土豆色素能提高D-半乳糖诱导的小鼠肝脏、脑组织中GSH-Px 酶的活性，其中，高剂量组与模型相比较差异显著(p ＜0.05)。T-AOC 反映的是机体总的抗氧化能力，它的下降表明机体整体的抗氧化能力降低。D-半乳糖诱导后给予色素后，与模型相比较，肝脏和脑中T-AOC 有增加趋势，在脑中中、高剂量组升高明显(p ＜0.05)，说明花色素苷对不同的器官作用有差异。MDA 是自由基攻击多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化的终产物，常用来衡量机体氧化损伤的程度，本研究结果显示，模型组肝脏中MDA 低于对照组，而脑中高于对照组，这一结论与文献［17-19］研究相吻合。刘晓秋等［17］对D-半乳糖衰老模型大鼠的自由基代谢进行综合分析，发现脑、胃、肝脏等脏器的线粒体的生化指标对衰老影响程度大于胞浆;Ho Shih-ching 等研究发现，D-半乳糖引起的氧化损伤与其浓度密切相关，且具有器官选择性，在浓度1%和5%的半乳糖诱导下，小鼠血液和脑中MDA 含量增加，SOD 活性下降;而在肝脏只有5%的半乳糖诱导下，MDA 含量增加，且在两个浓度下，SOD 酶活性与对照无显著差异。半乳糖处理小鼠当灌胃“黑美人”土豆色素后，MDA 含量与模型相比较差异显著，各剂量组间差异不显著，在肝脏和脑中MDA 低于模型组。MDA 含量的降低与抗氧化酶和非酶抗氧化物质有关，其次，花色素苷是多酚羟基的黄酮类化合物，可以螯合作为自由基反应的催化剂的过渡金属元素如Fe、Cu 等，来抑制脂质过氧化［20］，阻止脂质过氧化的链式反应，降低MDA 的生成，在一定程度上延缓衰老。

通过以上分析，不同剂量的“黑美人”土豆花色苷处理组显著升高了小鼠体重、血清中SOD 酶活性和肝脏中GSH-Px 酶活性，以及脑中T-AOC、SOD、GSH 酶活性，同时降低了肝脏和脑中MDA 含量。根据实验结果，说明“黑美人”土豆花色苷可以降低模型小鼠的氧化损伤程度，有一定的体内抗氧化功能。但是不同因素和途径对氧化损伤的部位和程度不同，机体抗氧化损伤的部位也有差异，导致机体内不同部位的抗氧化酶等生化指标也不尽相同。该研究对“黑美人”土豆活性成分的开发提供理论依据。

［1］Zhang Zi-Feng，Fan Shao-Hua，Zheng Yuan-Lin，et al.Purple sweet potato color attenuates oxidative stress and inflammatory response induced by D-galactose in mouse liver［J］.Food and Chemical Toxicology，2009，47(2):496-501.

［2］焦岩，王振宇.蓝靛果花色苷对高脂膳食诱导肥胖大鼠脂代谢和抗氧化能力的影响［J］.食品科学，2010，31(3):230-234.

［3］Kerrie L Kaspar，Jean Soon Park，Charles R Brown，et al.Pigmented potato consumption alters oxidative stress and inflammatory damage in men［J］.The Journal of Nutrition，2011，141(1):1-4.

［4］Zhang Bo，Kang Mu-Xing，Xie Qiu-Ping，et al.Anthocyanins from Chinese Bayberry Extract Protect β Cells from Oxidative Stress-Mediated Injury via HO-1 Upregulation ［J］.Journa of Agricultural and Food Chemistry，2011，59(2):537-545.

［5］Eddivari L，Vanamala J，Chintharlapalli S，et al.Anthocyanin fraction from potato extracts is cytotoxic to prostate cancer cells through activation of caspase - independent pathways［J］.Carcinogenesis，2007，28(10):2227-2235.

［6］高海宁，李彩霞，张勇，等.“黑美人”土豆色素体外抗氧化性研究［J］.天然产物研究与开发，2012，249(2):224-228.

［7］吴思荣，刘涛.黑色马铃薯种植模式对比实验及栽培技术［J］.农业科技与信息，2009(13):16.

［8］李彩霞，杨小龙，李琼，等.“黑美人”土豆色素稳定性的研究［J］.食品科学，2010，31(9):89-94.

［9］张勇，李彩霞，麻贝贝，等.大孔吸附树脂纯化“黑美人”土豆色素研究［J］.食品工业科技，2012，33(2):345-348，409.

［10］陈勤.中药美容保健品的研究与开发［M］.北京:中国医药科技出版社，1999:143-146.

［11］邱葵，司天润.用考马斯亮蓝测定动物药材中可溶性蛋白质含量方法初探［J］.中国中医药信息杂志，2007，14(4):49-50.

［12］邢秋娟，施杞，王拥军.D-半乳糖诱导衰老动物模型的机制及其在中医药方面的应用［J］.上海中医学大学学报，2010，24(3):93-98.

［13］李颖畅，孟宪军，孙靖靖，等.蓝莓花色苷的降血脂和抗氧化作用［J］.食品与发酵工业，2008，34(10):44-48.

［14］易龙，糜漫天.花色苷类植物化学物抗动脉粥硬化作用研究进展［J］.中华预防医药杂志，2009，43(4):333-335.

［15］李艳红，刘坚，江波，等.鹰嘴豆蛋白酶解物对D-半乳糖衰老小鼠抗氧化能力的影响［J］.营养学报，2008，30(2):162-164.

［16］方美善，张红英.桃仁提取物对痴呆模型小鼠组织SOD，GSH-Px 活性和MDA 含量的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18(12):236-238.

［17］刘晓秋，李卫东，唐惠琼，等.D-半乳糖衰老大鼠自由基代谢状况分析［J］.中国老年学杂志，2001，21(6):456-458.

［18］Ho Shih-ching，Liu jur-hao，Wu ReY-Yih.Establishment of the mimetic aging efeect in mice caused by D-galactose［J］.Biogerontology，2003，4(1):15-18.

［19］王春梅，李香艳，崔新颖.酸樱桃汁对D-半乳糖致衰老小鼠抗氧化能力的影响［J］.中药药理与临床，2011，27(3):87-90.

［20］嘉兴学，郑永霞.花色素苷药理功效的研究进展［J］.山西医药杂志，2008，37(3):255-257.