王 珍，李秀霞，李 娇，励建荣

(渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁省食品安全重点实验室，辽宁省高校重大科技平台“食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心”，辽宁锦州121013)

山楂(Crataegus pinnatifida Bge.)为药食同源性药材，根据药效学研究，具有扩冠、强心、降压、降脂作用，临床广泛用于治疗冠心病(如舒血宁)及高脂血症［1］。近年来国内外学者针对黄酮物质的检测方法进行了很多研究，彭全才等［2-3］研究利用反相高效液相法同时检测包括芦丁、金丝桃苷和槲皮素在内多种物质含量的检测方法，分离效果好，但是耗时在一个小时之内;张永超等［4］用高效液相检测山楂中各种黄酮的含量，单标分别检测;王光忠［5-6］等在30min内同时检测出芦丁和金丝桃苷的含量。据国内外研究成果表明［7-9］，山楂果实中含量最多的黄酮属槲皮素类，包括芦丁、金丝桃苷和槲皮素。鉴于此，笔者研究一种耗时短、重复性好、适合槲皮素类黄酮含量的快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芦丁标准品 中国药品生物制品检定所;槲皮素标准品 中国药品生物制品检定所;金丝桃甙标准品 宝鸡市辰光生物科技有限公司;高效液相色谱检测所用试剂均为色谱纯，水为超纯水。

高效液相色谱仪P680 美国戴安公司;电子天平FA2004 上海恒平科学仪器有限公司;旋转蒸发仪RE-2000上海亚荣生化仪器厂;超纯水机PS02-AD-DI 上海讯辉环保科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 待测样品的提取 原料的处理 山楂→去核→50℃烘干→磨粉→过筛→成品→密封包装

黄酮的提取方法:称取山楂粉5g，用滤纸包好，放入索氏提取器，100mL 70% 乙醇［10］，回流提取5～8h，直至回流液无色为止。70℃减压旋蒸浓缩，用甲醇定容于25mL 容量瓶中，待测。

1.2.2 高效液相色谱条件 色谱柱Develosil C30;流动相:A 相为乙腈，B 相为0.4%磷酸水溶液，梯度洗脱。B 相随时间变化:80% ～60.5% (0 ～26min)，60.5%～80% (26 ～26.1min)，80% (26 ～30min)流速1mL/min;柱温40℃，进样20μL;检测波长:360nm。

1.2.3 标准溶液的配制与曲线绘制 称取适量各标准品，置于10mL 的容量瓶中，分别加入色谱级甲醇，超声波助溶并定容至刻度，分别配成以下6 个浓度梯度的混合标准品溶液(见表1)，封口保存备用。按照上述色谱条件进行HPLC 测定，做峰面积对浓度的标准曲线，求出直线回归方程。

1.2.4 样品分析 在相同的液相色谱条件下，分别将标准溶液和样品溶液注入液相色谱仪中，以保留时间定性，以试样峰面积与标准比较定量。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的选择

称取山楂粉5g，用滤纸包好，放入索氏提取器，加入100mL 70%乙醇，回流5～8h，直至回流液无色为止。70℃减压旋蒸浓缩，用甲醇定容于25mL 容量瓶中，0.45μm 膜过滤，待测。

2.2 色谱条件的选择

本研究发现芦丁、金丝桃苷和槲皮素在360nm处有最大吸收波长，且杂质峰值小，流动相为乙腈和0.4%磷酸水溶液，流速为1mL/min;柱温40℃，进样20μL;检测波长:360nm。山楂黄酮标准品色谱分离图见图1，山楂黄酮样品色谱分离图见图2。图1 中芦丁、金丝桃苷和槲皮素三种物质的光谱扫描图像于图的右侧表示出，标准品的最大吸收波长能够大致确定该标准品，图2 样品图中，三种目标峰的出峰时间与标准品的出峰时间有所出入，但是借助光谱扫描图谱能够确定样品中的三种峰确实是三种被测物质。

2.3 标准曲线的建立

在规定的色谱条件下，将标准溶液进样20μL进行测定，结果表明芦丁在0.0005 ～0.16mg(R2=0.9999)范围内线性关系良好，回归方程为y =538.31x-0.3226;金丝桃苷在0.0016～0.05mg(R2=0.9996)范围内线性关系良好，回归方程为y =828.86x。槲皮素在0.0005 ～0.015mg(R2=0.9997)范围内线性关系良好，回归方程为y = 550.85x+0.044。

图1 黄酮标准品色谱分离图Fig.1 Standard chromatographic separation of figure of flavonoids from hawthorn

表1 混合标准溶液中各标准品的浓度表Table 1 The table of the concentration of standard substance in the mixed standard solution

2.4 方法学考察

图2 山楂黄酮样品色谱分离图Fig.2 Sample chromatographic separation of figure of flavonoids from hawthorn

2.4.1 精密度实验 精密吸取对照品溶液，重复进样6 次，按上述色谱条件进行测定，芦丁、金丝桃苷、槲皮素的峰面积的RSD 分别为0.78%、0.48%、0.69%，表明该检测方法精密度良好。结果见表2。

2.4.2 重现性实验 取同一批号样品按供试品溶液的制备方法平行制备5 份，按上述色谱条件进行测定，芦丁的平均含量为1.886mg/g，金丝桃苷的平均含量为 1.148mg/g，槲皮素的平均含量为0.664mg/g。RSD 分别为1.1%、1.4%、1.6%，表明该方法重复性良好。

表2 精密度测定结果Table 2 Result of accuracy experiment

2.4.3 回收率实验 称取已知各黄酮成分含量的山楂样品5g，准确加入芦丁、金丝桃苷和槲皮素标准品，按照2.1 样品液制备方法制备供试液。此测试液中黄酮成分的理论含量分别为:芦丁1.886mg/g、金丝桃苷1.148mg/g、槲皮素0.664mg/g，重复测定3次，计算样品的加样回收率，实验结果见表4。

2.5 样品含量的测定

对样品提取液检测结果表明，山楂中芦丁的含量为1.886mg/g，金丝桃苷的含量为1.148mg/g，槲皮素的含量为0.664mg/g。

3 结论

本实验目的建立高效液相色谱法测定山楂总黄酮提取物中芦丁、金丝桃苷和槲皮素的含量的方法。方法采用HPLC 法，色谱柱DevelosilC30;流动相:A相为乙腈，B 相为0.4%磷酸水溶液，梯度洗脱。B 相随时间变化:80%～60.5%(0 ～26min)，60.5%～80%(26～26.1min)，80%(26.1～30min)流速1mL/min;柱温40℃，进样20μL;检测波长:360nm。结果芦丁在0.005～0.16mg(R2=0.9999)范围内线性关系良好，回归方程为y =538.31x-0.3226，平均回收率为98.65%(RSD =0.383%);金丝桃苷在0.0016～0.05mg(R2=0.9996)范围内线性关系良好，回归方程为y =828.86x，平均回收率为94.15%(RSD =0.685%)。槲皮素在0.0005～0.015mg(R2=0.9997)范围内线性关系良好，回归方程为y =550.85x +0.0443，平均回收率为92.36%(RSD =0.306%)。

本实验对山楂黄酮的分析方法进行了改进，三种黄酮标准品的色谱峰得到了很好的分离且出峰时间短，三种黄酮均为槲皮素类黄酮，这为今后其它槲皮素类黄酮物质的高效液相检测提供理论依据。

表3 重现性测定结果Table 3 Result of reproducibility experiment

表4 山楂黄酮回收率测定结果Table 4 Result of the recovery experiment of hawthorn flavone

［1］国家药典委员会.中国药典2010 版.一部［S］.中国医药科技出版社.2010(30):372.

［2］彭全材，杨占南，胡继伟，等.高效液相色谱法同时测定鱼腥草中7 黄酮的含量［J］.江西师范大学学报，2008，32(6):645-648.

［3］韩哲，崔同，锁然，等.山楂果实中活性成分的高效液相色谱法［J］.食品科技，2006(6):124-126.

［4］张永超，哈云利，唐大力，等.高效液相色谱法测定山楂中芦丁和槲皮素的含量［J］.化学工程师，2006(3):52-53.

［5］王光忠，肖锦，闫磊，等.高效液相色谱法测定山楂总黄酮提取物中芦丁和金丝桃苷的含量［J］.湖北中医学院学报，2009，11(3):32-35.

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［8］Pengzhan Liu，Baoru Yang，Heikki Kallio.Characterization of phenolic compounds in Chinese hawthorn(Crataegus pinnatifida Bge.var.major)fruit by high performance liquid chromatographyelectrosprayionization mass spectrometry［J］. Food Chemistry，2010(121):1188-1197.

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