李 雪，牟光庆，陈历俊，* ，姜铁民

(1.大连工业大学食品学院，辽宁大连116034;2.北京三元食品股份有限公司，北京100076)

环境雌激素［1-2］属于环境内分泌干扰物，是指由于人类活动而释放到环境中的一类有害化学物质，这些物质进入生物体后能够扰乱生物体内分泌功能，通常被称为“外因型内分泌扰乱化学物质”。原料奶的质量是乳制品的根本，是保证奶制品食用安全、维护人类健康的基础。原料乳中是否存在雌激素至关重要，其中若残留激素，则对人体有一定的毒性［3］。本研究对原料乳中5 种雌激素进行了分析检测，其中既有内源性雌激素(雌酮、雌二醇和雌三醇)也有环境雌激素(己烯雌酚和双酚A)，都属于人工合成或自然界存在的，它们可通过食物链或直接接触等多种途径进入体内，模拟动物体内内源性激素，具有协同或拮抗正常的内源性激素的作用，干扰内分泌功能，多被称为环境雌激素。近来，对牛乳中环境激素检测的研究较多，常用的方法有:气相色谱-质谱(GC-MS)法、高效液相色谱(HPLC)法、酶联免疫吸附测定(ELISA)法、荧光分析法等［4-11］。例如张红英等人［11］的研究是在有机溶剂提取的基础上对样品进行衍生，然后采用气相色谱-质谱法检测原料乳，但是前处理过程复杂，并且接触大量的有毒试剂，需要长时间的衍生化过程。而本文用固相萃取替代衍生过程，优化了提取、净化、色谱测定等参数，成功建立了固相萃取、LC-MS 测定原料乳中5 种环境雌激素残留量的方法。不仅提高了分析样品的工作效率，还在优化前处理方法的基础上，取得了比较满意的结果。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

原料奶 采自北京市11 个不同的奶牛养殖场;雌三醇标准品 纯度97.4%、雌二醇标准品 纯度96.7% 中国药品生物制品检定所;雌酮标准品 纯度99.5%、双酚A 标准品纯度98.5%德国Dr.Ehrenstorfer 公司;己烯雌酚标准品 纯度99.7%，中国计量科学研究院;甲醇HPLC 级、乙腈LC/MS级 美国Fisher 公司;氮气、氩气(＞99.999%);超纯水 美国Milli-Q 纯水系统制;其他试剂均为市售国产分析纯试剂。

ACQUITY Ultra Performance LCTM 超高效液相色谱仪、Quattro Premier Micromass 质谱仪、MassLynx数据处理系统 美国Waters 公司;KQ-500DE 医用数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;Sigma 2K-15 高速冷冻离心机 博劢行仪器有限公司;Cleanert NH2-SPE 固相萃取柱 500mg/3mL 美国Agela 公司;旋转蒸发仪RE-52A 上海振捷实验设备有限公司;SHB-Ⅲ型水循环真空泵 郑州市上街区仪器厂。

1.2 LC-MS/MS 条件

1.2.1 色谱条件 色谱柱:ACQUITY UPLCTM HSS T3(2.1 ×50mm，1.8μm);流动相:乙腈-甲醇(4∶1，A)与0.01%氨水(B)，流速0.3mL/min，梯度洗脱程序见表1;柱温35℃;样品室温度25℃;进样量为10μL。

表1 梯度洗脱程序Table 1 The program of gradient elution

1.2.2 质谱条件 电喷雾离子源;负离子扫描模式;毛细管电压2.37kV;离子源温度120℃;去溶剂气温度450℃;去溶剂气流量800L/h;锥孔气流量50L/h;碰撞气体为氩气，碰撞气流速度为0.14mL/min，多反应检测(MRM)模式检测。

1.3 标准溶液的配制

分别称取标准品10.0mg 于10mL 容量瓶中，加入乙腈溶解并稀释定容，得到质量浓度为1.0g/L 的单标准储备溶液，于-20℃冰箱保存备用。分别取上述储备液用乙腈-水(1∶1，v/v)或乙腈-0.01%氨水(1∶1，v/v)稀释为1mg/L 的标准溶液用来优化质谱条件。

各取单标准储备液适量，用初始流动相做稀释液配制所需浓度的混合标准溶液。

1.4 样品前处理

量取2mL 原料奶样品于15mL 离心管中，加入10mL 乙腈，漩涡混匀1min，于25℃超声25min，在4℃下以12000r/min 离心10min，移取上清液，待上清液恢复至室温后过NH2柱。在NH2柱中加入约2cm高无水硫酸钠(经650℃烘烤4h，保存在干燥器内，冷却后备用)，下接旋转瓶放在固定架上。加样前先用4mL 乙腈-甲苯(3∶1)预洗柱，当液面到达硫酸钠的顶部时，迅速将上清液转移到净化柱上，再用25mL 乙腈-甲苯(3∶1)洗涤柱子，收集所有流出物于旋转瓶中并在40℃水浴中旋转蒸发浓缩至近干。用1mL 乙腈/甲醇4∶1-0.01%氨水(2∶3，v/v)溶液溶解残渣，经0.22μm 滤膜过滤，移入1.5mL 自动进样器样品瓶中，供HPLC-MS/MS 测定。

2 结果与讨论

2.1 样品处理方法的选择

2.1.1 提取溶剂的选择 这5 种环境雌激素都属于疏水性有机化合物，易溶于大多数有机溶剂。本实验采用超声提取方式对样品进行提取，先后比较了甲醇、叔丁基甲醚、乙腈和乙酸乙酯4 种溶剂的提取效果，得到5 种环境雌激素的回收率，如图1 所示。结果发现，乙腈能有效沉淀蛋白质，其总提取效率最高，且提取液清澈，本地干扰少;由于牛乳本身含有很多脂溶性化合物，以叔丁基甲醚和乙酸乙酯为提取剂时乳化现象严重，即使在12000r/min 条件下离心10min 也不能很好的消除乳化现象，从而造成提取液中含有大量的杂质，给接下来的净化工作带来了很大的困难，而且乙酸乙酯提取环境雌激素的回收率低于20%;甲醇提取效果没有乙腈好，且甲醇很难与水相分层，提取液中残存少量杂质，不利于净化过程，易造成固相萃取小柱堵塞。实验也考察了在提取过程中加入三氯乙酸和0.1%乙酸溶液对蛋白质和脂肪的沉淀效果，以期能得到更纯净的提取液，结果表明，加入0.1%乙酸溶液的样品过固相萃取柱时会使小柱堵塞;而加入三氯乙酸溶液的样品提取率反而降低，因此，选择乙腈作为本实验的提取溶剂。通过不同提取温度(20、25、30℃)和超声时间(20、25、30min)对提取效率的影响发现，在25℃下超声25min 时提取效率最高，故本实验选择在此条件下进行提取。

2.1.2 固相萃取净化条件的选择 通过实验，比较了PEP 柱、C18柱和NH2柱的净化效果，发现3 种固相萃取小柱对这5 种化合物有不同的吸附能力，回收率范围在25%～105%之间，其中NH2小柱的平均回收率最高，均在68%以上，且结果稳定，见图2。这可能是由于NH2柱作为正相萃取柱，其键合硅胶填料极性相对较强，更适合从非极性溶剂中提取弱极性到中等极性物质，通过用非极性有机溶剂活化和洗脱，能很好地将目标物洗脱下来，而牛乳中强极性表面活性物质仍吸附在小柱上，再通过旋转蒸发浓缩和溶剂交换，可以除去样品中的非极性干扰物质。文献报道，采用C18或HLB 柱净化激素类药物时，上样溶液的组成影响回收率和净化效果，而通常采用再与NH2柱双结合的方式进一步进化［12］。通过实验证明，乙腈不仅洗脱回收率高，净化效果也好，且只需NH2柱即可达到净化目的，因此本实验选择NH2柱为固相萃取净化小柱。

图1 提取溶剂对牛奶样品中5 种环境雌激素回收率的影响Fig.1 Influence of selected solvents on the recoveries of 5 environmental estrogens in bovine milk

图2 固相萃取柱对牛奶样品中5 种环境雌激素回收率的影响Fig.2 Influence of solid phase extraction columns on the recoveries of 5 environmental estrogens in bovine milk

2.2 色谱条件的优化

根据文献和实验证明，反相HPLC 技术用于这5种环境雌激素的分析检测，在此基础上选用ACQUITY UPLCTM HSS T3柱(2.1 ×50mm，1.8μm)和ACQUITY UPLCTM BEH C18柱(2.1 ×50mm，1.7μm)作为分离色谱柱进行实验。文献中报道，BEH C18色谱柱属三键键合，适合在负离子电离模式条件下对激素类物质的检测［8］，但由于不同的色谱柱对同一样品有不同的保留时间，经过实验证明，HSS T3柱由于填料颗粒细，使峰形更加对称尖锐、信噪比更高，比BEH C18柱更适合用于疏水性物质的分离检测，且能将这5 种目标物质全部分离，分析时间更短，8.5min即可完成5 种物质的全部分离检测，因此选用ACQUITY UPLCTM HSS T3柱作为分离色谱柱。

实验研究比较了在甲醇-水、乙腈-水二元溶剂体系，以及流动相体系中分别加入0.1% 甲酸、10mmol/L 乙酸铵、0.1%氨水、0.01%氨水等对这5 种环境雌激素电离喷雾的影响。实验发现，以乙腈为流动相的各环境雌激素信号响应强度稍逊于甲醇，但是峰形比甲醇要好，且保留时间早，而在乙腈中加入一定比例的甲醇，效果更佳。在流动相中加入0.01%氨水后流动相的pH 为9 左右，色谱柱HSS T3具有较宽的pH 应用范围，且分离这5 种环境类激素时柱效高，这与文献中所报道的效果基本一致［12］，故最终决定以乙腈/甲醇(4 ∶1)-0.01%氨水作为流动相，此时可以得到最优的色谱分离效果和质谱信号响应，获得对称、尖锐的峰形，且基线平稳。这5 种环境雌激素的MRM 色谱图见图3。

2.3 质谱条件的优化

采用流动注射泵连续进标准样品，由于这5 种环境雌激素的分子结构中含有大量的-OH，易于脱去一个H 而形成［M-H］-离子峰，故选择在电喷雾负离子模式下进行母离子全扫描，考察质谱响应。然后对雌酮、雌二醇、雌三醇、己烯雌酚和双酚A 进行二级质谱分析，最终选择离子丰度高、基线噪音低的2 对离子，同时进一步优化碰撞能量、质谱分辨率等质谱参数，使各个离子的质谱响应信号达到最高。然后对离子源温度、去溶剂气温度及流量、锥孔气流量进行优化，使离子化效率达到最佳。优化的质谱条件见表2。这与文献中报道的质谱条件相一致［5-6］。

表2 5 种环境雌激素的质谱检测参数Table 2 MS parameters for the determination of 5 environmental estrogens

2.4 方法的定性、定量、线性范围和检出限

精确配制一系列混合标准工作溶液，在选定的色谱条件和质谱条件下进行测定，以峰面积(Y)为纵坐标、质量浓度(X)为横坐标进行回归分析，由实验得出的线性回归方程、线性范围、相关系数、LOD 和LOQ 如表3。其中，以3 倍信噪比(S/N)为方法检出限(LOD)，10 倍信噪比(S/N)为方法定量限(LOQ)，经样品添加实验确定各物质的检出限和定量限。

2.5 方法的添加回收率与精密度

本实验采取外标定量法，在空白样品中添加目标化合物，对原料奶分别进行添加回收率和精密度实验，样品中添加不同浓度的混合标准溶液，按本实验前处理方法进行处理，用高效液相色谱-串联质谱法进行检测。在低浓度、中浓度、高浓度3 个添加水平范围内测定平均回收率(每个添加浓度平行测试6次)，其平均回收率及相对标准偏差(RSD)结果见表4，内源性激素需扣除空白值。样品加标色谱图见图4。

表3 5 种环境雌激素的回归分析、检出限和定量限Table 3 Regression analysis，limits of detection(LOD，S/N=3)and limits of quantification(LOQ，S/N=10)of 5 environmental estrogens

图3 5 种环境雌激素的MRM 图Fig.3 MRM of 5 environmental estrogens

表4 原料奶基质中5 种环境雌激素的添加回收率和精密度(n=6)Table 4 The recoveries and accuracies of 5 environmental estrogens in bovine milk(n=6)

图4 牛奶样品加标色谱图Fig.4 Standard chromatogram of the milk sample

2.6 样品测定

应用本方法对来自11 个不同养殖场的原料奶进行了分析测定，结果显示，选择的11 个原料奶样本中6 个样本中检测出雌酮(2.1～4.3μg/L)，3 个样本中检测出己烯雌酚(2.4～4.6μg/L)，5 个样本中检测出双酚A(3.9～4.2μg/L)，其他激素均为未检出。其中，雌酮的含量属于内源性激素范围，检出结果与文献［12］报道牛奶中内源性激素含量一致;而己烯雌酚和双酚A 的痕量存在也是极有可能的，由于养殖场的微环境因素(土壤、空气、水源)的影响，这两种物质通过富集等途径残存在环境中，又被植物吸收，极有可能会在奶牛体内得以转换和富集，而且在实验检测过程中，不可避免的会使用塑料制品(如仪器管路，离心管等)，而奶样的前处理过程中又大量使用了有机溶剂，会使塑料制品中存在的痕量双酚A部分溶出，进入所测样品中，故双酚A 的含量在允许范围内存在，这与文献［11］中的检测结果相一致。

3 结论

本研究以原料奶为基质，详细研究了样品的前处理方法，优化了高效液相色谱分离条件和串联质谱测定条件，建立了固相萃取净化与高效液相色谱-串联质谱法多组分同时检测原料奶中5 种环境雌激素的分析方法，该方法采用外标法定量，保证了方法的准确性。本方法操作简单快速、灵敏度高、分析时间短、回收率较好、结果准确且方法稳定，适合于大批量样品的快速检测。在当今乳制品质量安全备受关注的环境下，该方法能为牛乳中环境雌激素的监管与监督提供技术依据，且可应用于牛奶的实际检验工作和产品质量控制，有一定的应用价值。

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