马荣山，王宜琦，* ，娄 怡，刘志会，张祖奎，马千里

(1.沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳110866;2.辽宁建平福泽酒业有限公司，辽宁朝阳122400)

沙棘(Hippophae rhamnoides Linn.)，又称醋柳、黄酸刺、酸刺柳、黑刺、酸刺，是被子植物门双子叶植物纲蔷薇目胡颓子科沙棘属，沙棘是一种落叶性灌木，对土壤适应性强，是防风固沙，保持水土，改良土壤的优良树种。其果实吸取天地精华，含有丰富的VC、VE、VD、VB1、黄酮、氨基酸、有机酸及其它人体所需微量元素［1］，其中尤以黄酮、VC含量较其它水果之冠［2-3］。我国沙棘资源十分丰富，但由于沙棘本身味道较酸，口感较差，直接食用难以被人们所接受，所以沙棘果农的经济收益不是很好，每年有大量的沙棘被浪费掉了，而沙棘果酒的发展能够带动地方经济、生态、产业等效益的发展，并且符合当今美容保健的消费趋势［4-5］。流加发酵法是以分批培养为基础，间歇或连续地补加新鲜培养基的一种发酵方法。由于酵母菌的最适糖度为12%，过高的糖环境不利于酵母菌的生长及发酵［6］，然而在发酵过程中12%的糖度较低，又不足以满足酵母菌的需求，生产出的果酒中酒精体积分数低，糖度过量又会导致残糖过高影响果酒品质，因此采用流加发酵方法来解决这个问题［7-8］，而且流加发酵使得酵母菌代谢发生变化，发酵更加完全，有利于果酒香气的呈现和溢出，营养健康、果香醇厚的消费饮品符合目前市场需求，长期饮用可以达到保健的目的，而目前对于流加发酵法生产沙棘果酒的相关研究尚未见报［9-10］。为此本实验旨在采用流加发酵方法而得到香气醇正、酒精体积分数较高的沙棘果酒，以期对沙棘深加工产品的开发研究提供一定的理论依据。

表1 沙棘果酒感官指标评价标准Table 1 Evaluation standard of the sensory perception index of Seabuckthorn wine

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

沙棘汁 辽宁建平福泽酒业有限公司;饴糖 沈阳科新食品添加剂有限公司生产;碳酸钾 AR;果胶酶 河南郑州雅大生物工程股份有限公司(酶活5000U/mL);偏重亚硫酸钠 AR;酵母 安琪牌葡萄酒高活性干酵母。

数显恒温水浴锅(HH-6) 国华电器有限公司;恒温培养箱 南京实验仪器厂;101-1A 型电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司;酒精计 河北省河间市仪表厂;手持糖度仪 成都光学厂;PHS-25C 型精密pH 计 上海康仪仪器有限公司;7890GC/5975MS(气相-质谱联用仪) 美国Agilent公司;PDMS 萃取头、手动SPME 进样器 美国Supelco 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程

1.2.2 操作要点［11］取1000mL 沙棘果汁，用浓度为75%的饴糖调整糖度、K2CO3调整酸度后，向其中加入0.3%的果胶酶，用以除去其中果胶物质，来提高沙棘果酒稳定性，再向其中加入偏重亚硫酸钠来除去杂菌，经过65℃的巴氏灭菌30min 后，接入活化好的酵母菌1‰，在18℃下发酵10d，加入2%的硅藻土以吸附其中的酵母细胞及悬垂的蛋白质等。沙棘汁的固形物含量为9%，酸度为19g/L。

酶解:由于沙棘果汁中含有蛋白质、果胶等物质，影响沙棘果酒的稳定性，而加热处理温度高易导致沙棘汁色泽加深、苦涩味加重、破坏营养成分，故采用果胶酶来处理其中的果胶，并且酶解还具有提高出汁率的作用。

沙棘果酒采用低温发酵，在成酒过程中能产生较多的高碳有机酸酯，是产香的主要来源，且低温发酵能较好的保持原汁中的果香。

气相色谱条件:Agilent 毛细管色谱柱DB1701 弹性石英毛细管柱(30m ×0.25mm，0.25μm)，进样口温度250℃，程序升温:初始温度80℃，保持5min，以5℃/min升至200℃，再以10℃/min 升至270℃，保持5min。

质谱条件:电离方式EI，70eV，离子源温度:230℃，质量扫描范围:35～400amu，发射电流100μA，检测电压1.4kV，对采集到的质谱图利用NIST02 谱库进行检索。

1.2.3 主要测定方法 pH:pH 计法;还原糖:3，5-二硝基水杨酸比色法;固形物含量:折光仪;酒精体积分数:蒸馏法;酸度:滴定法;香气成分:气相色谱-质谱联用。

1.3 实验设计

1.3.1 单因素实验设计 在上述条件保持不变的情况下，分别考察初始糖度、流加糖时间、流加糖量对于酒的体积分数的影响。流加糖的时间为2～8d;流加次数为1～4 次;流加量为20～40mL。发酵过程每天测还原糖含量，至还原糖含量变化不大时结束发酵，确定发酵时间，测定发酵液最终酒精体积分数并进行感官评定。

1.3.2 响应曲面优化设计 结合单因素实验结果，采用Box-Behnken 设计模型，选择初始糖度、流加糖时间、流加糖量作为影响因素，以酒的体积分数作为响应值，采用3 因素3 水平的响应曲面法设计实验，利用Mintanb15 软件进行数据处理和回归分析。

表2 Box-Behnken 设计因素及水平表Table 2 Variables and levels in Box-Behnken central composite design

2 结果与分析

2.1 单因素结果分析

由表3 可以看出，在发酵第3、4、5、6、7、8d 流加相同量的糖，酒精体积分数都有所提高。发酵前2d酵母处于增殖阶段，消耗还原糖少，此时加糖会加大发酵液的渗透压，不利于酵母菌的生长繁殖，酒精体积分数比第3～6d 流加糖的酒精体积分数较低，残糖量较高。第7、8d 流加糖，此时处于发酵后期，酵母大多数已经老化死亡，此时加糖，酵母利用糖不充分，使发酵液残糖过高，酒精体积分数低。发酵第3～6d流加糖，此时处于发酵旺盛阶段，酵母活性高，发酵剧烈，此时加糖对提高酒精体积分数效果显著。

由表4 可以看出，较一次流加糖，分次流加的酵母菌对还原糖的利用较充分，酒精体积分数有所提高。在第3、4、5d 流加糖效果最好，酒精体积分数最高，流加后发酵剧烈，酒质较好。

表3 不同流加糖时间的发酵结果比较Table 3 Comparison of fermentation with different fed time of caramel

表4 不同流加次数的发酵结果比较Table 4 Comparison of fermentation with different rates of adding

由表5 可以看出，当流加糖为20mL 时，糖添加量不够，酒精体积分数较低。流加糖量为30mL 时，效果最明显，酒精体积分数最高。当流加糖量为40mL 时，酒精体积分数较高，但残糖量高，还原糖不能充分利用，得到的果酒口味协调纯正，酸甜适中。因此选择糖流加量为25～35mL。

表5 不同糖流加量的发酵结果比较Table 5 Comparison of fermentation with different amount of caramel

2.2 拟合模型的建立及方差分析

应用Minitab 软件对表2 数据进行多元回归拟合，回归方程为

表6 Box-Behnken 实验设计及结果Table 6 Box-Behnken experiment design and results

从表7 可以看出，回归性表现极显著，其中线性、平方、交互作用模型的显著水平均远远小于0.05，表现极显著。失拟项大于0.05 不显著，表明该方程与实验拟合较好，该响应模型适用于本次实验，可以反映出实验结果。

表7 回归模型的方差分析Table 7 Analysis of variance of the developed regression equation

从表8 可以看出，方程中的X1、X3、X12、X1X2、X2X3极显著，X32显著，X2、X1X3、X22不显著，其影响强弱依次为X2X3、X1X2、X1、X12、X3、X32、X1X3、X2、X22，表明各个影响因素与响应值之间不是简单的线性关系。

表8 回归方程系数显著性检验Table 8 The significant test of regression coefficients

2.2 响应面图形分析

由图1 可知，酒精的体积分数受初始糖度和流加天数的交互作用影响，当流加天数为3、4、5d 时，酒精体积分数随初始糖度增大而增大;当流加天数为3、4、5、6d 时，酒精体积分数随初始糖度增大而呈先增大后减小趋势。当初始糖度为10%时，酒精体积分数随流加天数增大而增大;当初始糖度为12%时，酒精体积分数随流加天数增大而减小。所以，当初始糖度处于较高水平，流加天数处于较低水平时，酒精体积分数相对较高。

图1 酒精体积分数与初始糖度、流加天数的响应面图Fig.1 Response surface for alcohol concentration under initial caramel and fed-batch fermentation time

由图2 可知，当流加糖量为25mL 时，酒精体积分数随初始糖度增大而增大，后期变化较小;当流加糖量为35mL 时，酒精体积分数随初始糖度增大而呈先增大后减小的趋势。当初始糖度为10%时，酒精体积分数随流加糖量增大而增大;当初始糖度为12%时，酒精体积分数随流加糖量增大而呈先增大后减小趋势，但变化不大。

图2 酒精体积分数与初始糖度、流加糖量的响应面图Fig.2 Response surface for alcohol concentration under initial caramel and caramel inoculating amount

由图3 可知，酒精体积分数受流加天数与流加糖量共同作用的影响，当流加糖量为25mL 时，酒精体积分数随流加天数增大而增大;当流加糖量为35mL 时，酒精体积分数随流加天数增大而减小。当流加天数为较低水平时，酒精体积分数随流加糖量增大而增大，且变化值非常大;当流加天数为较高水平时，酒精体积分数随流加糖量增大而减小，但变化较小。故当流加天数取较低水平，流加糖量取较高水平时，酒精体积分数相对高，这与酵母代谢密切相关。

图3 酒精体积分数与流加天数、流加糖量的响应面图Fig.3 Response surface for alcohol concentration under fed-batch fermentation time and caramel inoculating amount

2.3 流加工艺优化及验证

通过Minitab 软件的响应优化器得到了最优工艺:初始糖度为11.8%、流加时间为3d +4d +5d、流加糖量为35mL，编码值分别为0.8182、-1、1，预测酒精体积分数结果为11.7833%。验证该结果做三次平行实验，酒精体积分数平均为11.9%，酸度达6.5g/L，糖度1.1%，酒的体积分数较高，酸度较低，残糖量低几近消耗殆尽，达到了优化流加工艺的目的。其中调整糖度加入了25mL 饴糖，流加总糖加入105mL，共加入饴糖130mL。

相同条件下做未流加发酵的沙棘果酒，加入130mL 饴糖，糖度调整至19%，发酵至终，得到酒精体积分数为11.0%的沙棘果酒，酸度达6.8 g/L，糖度达3.2%。

2.4 流加发酵与非流加发酵的沙棘果酒香气分析

2.4.1 香气成分质谱分析总离子色谱图 由于本实验仅意图比对流加与未流加两种发酵工艺生产的沙棘果酒香气，故未用内标法进行实际定量，采用顶空固相微萃取法，流加与未流加发酵的果酒均在相同条件下进行香气测定。其总离子流图见图4、图5。

图4 流加发酵工艺生产的沙棘果酒的香气成分总离子色谱图Fig.4 GC-MS total ion chromatogram of flavor components in Hippophae rhamnoides wine through the Fed-batch fermentation process

图5 非流加发酵生产的沙棘果酒的香气成分总离子色谱图Fig.5 GC-MS total ion chromatogram of flavor components in Hippophae rhamnoides wine not through the Fed-batch fermentation process

2.4.2 流加发酵与非流加发酵生产的沙棘果酒香气成分及相对含量分析 由图4、图5 可知，本实验中鉴定出匹配度在80 以上的香气成分有酯类、醇类、酸类、烷烃和芳香族化合物。未经流加发酵生产的沙棘果酒中检测出15 种香气成分，其中含量较高的为酯类(40.50%)、醇类(12.00%)、酸类(8.16%)、烷烃(3.82%)，而经过流加发酵的沙棘果酒中检测出22 种，其中含量较高的有酯类(52.31%)、醇类(12.04%)、酸类(7.80%)、烷烃(4.28%)，还有芳香族化合物(2.05%)。

酯类物质是影响果酒香气的重要成分，它们除来源于果实本身外，大部分来自于发酵的过程，在未流加的沙棘果酒中酯类检测出7 种，其中含量最高的辛酸乙酯，其次是己酸乙酯，流加发酵的沙棘果酒有9 种，其中含量最高的为辛酸乙酯，其次为2-苯基-醋酸乙酯，流加发酵比较未流加发酵的沙棘果酒，无论酯类的种类、相对含量和峰面积，前者均高于后者。适量的醇类可以赋予果酒浓郁芬芳的感官特性，但含量过高，则会产生不愉快的味道，两者的醇类均为苯乙醇和2，3-丁二醇，苯乙醇含量较高。酸类均为癸酸和辛酸，流加发酵的较未流加的酸类含量略低，沙棘果本身味酸，酸度过高影响口感。未流加果酒的烷烃为1-甲氧基-3-甲基-丁烷，流加的果酒烷烃为2，3，4-三甲基戊烷和3-乙氧基-甲基三(三甲基硅氧烷基)硅烷。芳香族化合物在果酒中含量少，但其香味特点突出，能够赋予酒体醇厚的风味，流加发酵的果酒中含有4-乙基苯酚和异丙酚，而未流加的果酒中未检出芳香族化合物。

香味呈现的作用机制非常复杂，它不仅仅和发酵原料有关，更与酵母的代谢过程息息相关，流加发酵相比未流加发酵生产的沙棘果酒，果香较浓郁、口感较醇厚、酸味较低、后味更重。

3 结论

3.1 采用响应曲面来确定最佳沙棘果酒的流加工艺，初始糖度为11.8%、流加时间为3d+4d+5d，流加糖量为35mL，预测酒精体积分数可达11.7833%，实际考察得到平均酒精体积分数为11.9%的沙棘果酒，而未流加发酵生产的果酒的酒精体积分数仅为11.0%。

3.2 采用GC-MS 分析测定流加发酵与未流加发酵的沙棘果酒的香气成分，分别鉴定出匹配度大于80的香气种类有22 种和15 种，其中前者的酯类有9种，后者有7 种，前者峰面积较高;二者的醇类物质均为2 种;酸类物质均为2 种，流加较未流加峰面积低，物质浓度低;烷烃类前者含2 种，后者含1 种;芳香族化合物前者测出2 种，而后者无。表明流加发酵对于沙棘果酒的酒体积分数有所提高，残糖低，香气有所改善，而香气的产生机理及各种香气之间的作用机制的这一方面研究还有待于深入探索。

［1］王大为，张艳荣，张雁南.发酵型沙棘果酒生产工艺的研究［J］.食品科学，2003，24(5):119-120.

［2］程玉倩.沙棘酒发酵过程中主要成分变化的分析［J］.酿酒，2008，35(2):78-79.

［3］Upadhyay NK，Kumar R，Mandotra SK.Safety and healing efficacy of Sea buckthorn(Hippophae rhamnoides L.)seed oil on burn wounds in rats［J］.Food and Chemical Toxicology，2009，47(6):1146-1153.

［4］李秋.沙棘果醋的研制及其成分分析［D］.无锡:江南大学，2008.

［5］胡丽红.红枣醋及枣醋饮料生产工艺的研究［D］.乌鲁木齐:新疆农业大学，2009.

［6］刘秋玲.活性干酵母耐糖实验研究［J］.酿酒，2001，28(3):46-47.

［7］马荣山，王艳平，穆晶.响应面法优化树莓酒流加发酵工艺［J］.中国酿造，2011(11):86-87.

［8］马荣山，郭丹.流加法发酵生产较高酒精体积分数蜂蜜酒［J］.中国酿造，2008(21):56-59.

［9］陈新军，刘树文，张予林.新天霞多丽干白葡萄酒香气成分的GC/MS 分析［J］.中外葡萄与葡萄酒，2007(4):11-14.

［10］王树林，樊明涛.青海沙棘干酒与冰酒香气成分的分析及比较［J］.食品与发酵工业，2010，36(5):120-121.

［11］姜培，康健，王玲，等.新疆沙棘原浆的综合利用［J］.食品与发酵工业，2011，37(5):234-237.