王程程，赵 玲，李敏通，王蓉晖，李延斌，胡耀华，*

(1.西北农林科技大学机械与电子工程学院，陕西杨凌712100;2.阿肯色大学生物与农业工程系，美国阿肯色费耶特维尔72701)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)是最常见的食物中毒病原菌之一，广泛存在于自然界中，如空气，水，人和动物的排泄物等，因此，食品很易受其污染［1-2］。金黄色葡萄球菌呈革兰氏阳性，可分泌多种毒性蛋白质，其分泌的金黄色葡萄球菌肠毒素可引起人类胃肠性多种疾病［3］。在美国，由其引起的食物中毒居第二位，占整个细菌性食物中毒的33%，在加拿大占45%［4］，我国每年此类中毒事件也屡有发生，金黄色葡萄球菌污染及其肠毒素已是世界性卫生问题［5-6］。传统检测病原微生物的方法步骤较繁琐，检测周期长，在低浓度菌量下易出现漏检，多数免疫学检测所需成本高且耗时，对样品要进行复杂的预处理［7］，难以满足食品安全事件中快速准确的检测需求。免疫磁珠(Immunomagnetic Beads，IMBs)具有选择性好，特异性强，能将目标菌从复杂的食品基质中快速分离出来，起到快速分离、富集细菌的作用［8］。目前，国内外已有学者利用免疫磁珠与其他检测方法结合，如酶联免疫法，PCR，量子点荧光检测等对沙门氏菌［9-12］，大肠杆菌［13-14］，李斯特菌［15-17］，阪崎杆菌［18］等多种食源性微生物进行检测研究，利用免疫磁珠对金黄色葡萄球菌的检测尚处于探索阶段［19］。本研究拟利用生物素化的金黄色葡萄球菌多抗包被链酶亲和素磁珠制备免疫磁珠，对金黄色葡萄球菌免疫捕获，结合传统平板菌落计数，计算捕获效率。通过实验优化建立基于免疫磁分离技术对金黄色葡萄球菌的快速分离方法，并利用该方法捕获人工污染该菌的羊肉卷洗水样品，验证该方法用于食品样品的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金黄色葡萄球菌标准菌株(ATCC27660) 由上海慧耘生物科技有限公司提供;福氏志贺氏菌(ATCC12022) 购于美国菌种保藏所;冷冻羊肉卷(内蒙古草原兴发) 购自杨凌好又多超市;链霉亲和素磁珠(180nm，2mg/mL) 购于江阴美英特公司;生物素化兔抗金葡菌多克隆抗体(4～5mg/mL) 购于美国Thermo 公司;Baird-Parker 培养基基础、亚碲酸钾卵黄增菌剂、LB 肉汤、营养琼脂 均购于北京陆桥;PBS 缓冲液 购于Sigma 公司;牛血清蛋白 购于沃尔森公司。

纳米磁分离器MS0206 购于江阴美英特公司;智能恒温恒湿箱HWS-250 购于海曙赛福仪器厂;漩涡混合器VORTEX-5、旋转摇床QB-210 均购于其林贝尔公司。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫磁珠的制备

1.2.1.1 磁珠与多抗的偶联 分别取1.0mL(即2mg)的链霉亲和素磁珠5 份于离心管中，用1.0mL的PBS(0.01mol/L，pH 7.4，后面均相同)清洗三遍，弃去清洗液，向其中分别加入10、30、50、70、100μL的生物素化兔抗金黄色葡萄球菌多抗(4～5mg/mL)后，向其中分别依次加入PBS 缓冲液490、470、450、430、400μL(保证混合液体积在500μL，这样可充分振荡均匀)，室温下(28℃左右)以15r/min 振荡30min［15-16］。置于纳米磁分离器(0.4T)中，磁分离1.5min 使磁珠充分吸附后，吸去试管中的液体，再加入1.0mL PBS 清洗三遍后，用1.0mL PBS 重新分散磁珠。

1.2.1.2 免疫磁珠的封闭 磁分离上述免疫磁珠，去除液相后，取1mL 1% BSA 的PBS 缓冲液加入各管中，封闭振荡(15r/min)1h 后，磁分离用PBS 彻底清洗三次。加入1.0mL 的PBS 重新分散免疫磁珠，并标记为IMB-10、IMB-30、IMB-50、IMB-70、IMB-100，4℃保存备用。

1.2.2 免疫捕获金黄色葡萄球菌条件优化

1.2.2.1 多克隆抗体包被链霉亲和素磁珠加入量的优化选取 分别取IMB-10、IMB-30、IMB-50、IMB-70、IMB-100 各60μL，加入到1.5mL 离心管中，磁分离后，加入菌悬液500μL，同时作只加入500μL菌悬液的阳性对照，在室温下以15r/min 振荡孵育45min，置于纳米磁分离器中，磁分离1.5min 使磁珠充分吸附后，吸出废液收集，用PBS 清洗两遍，收集洗液，废液和洗液混合于1.5mL 离心管中，IMB-菌复合物重新分散在1.0mL PBS 中。将阳性对照，IMB-菌悬液，废液按10 倍梯度稀释至103或102CFU/mL，分别取100μL 在Baird-Parker 平板上铺盘，平行三次铺盘。参考GB 4789.10-2010 将涂布好的平板在37℃培养45～48h 后计数。

计算捕获效率:W(%)=Nb/N0×100

式中:W-免疫磁珠对金黄色葡萄球菌的捕获效率(%);Nb-免疫磁珠捕获到的金黄色葡萄球菌细菌数(CFU);N0-阳性对照中金黄色葡萄球菌细菌总数(CFU)。

1.2.2.2 免疫磁珠加入量的优化选取 取免疫磁珠IMB-50，加入量分别为20、40、60、80、100μL 于5 个1.5mL 离心管中，具体操作同上，振荡反应45min，磁分离后平板菌落计数，计算捕获效率。

1.2.2.3 免疫捕获时间的优化选取 取4 份60μL 免疫磁珠IMB-50，具体操作同上，分别和菌悬液振荡反应20、45、70、95min，磁分离后平板菌落计数，计算捕获效率。

1.2.2.4 正交实验设计 根据单因素实验结果，选用L9(34)正交表，以抗体加入量，免疫磁珠加入量，免疫捕获时间为考察因素，进行4 因素3 水平(设一空列)的正交实验，选取浓度为103CFU/mL 菌液进一步优化免疫磁捕获的条件。因素水平表如表1 所示。

表1 正交实验因素水平表Table 1 The table of levels and factors to orthogonal test

1.2.3 免疫磁珠对不同浓度菌液的捕获 将1mL 的金黄色葡萄球菌冻存液加入到9mL 灭菌LB 肉汤，混合均匀，37℃培养20h，用PBS 10 倍梯度稀释，选取103、104、105、106CFU/mL 的菌悬液，按照正交实验优化的捕获条件对以上浓度的菌悬液捕获，参照方法1.2.2.1，重复3 次，计算捕获效率，检验优化出的捕获条件是否可行。

1.2.4 灵敏度实验 选取100、101、102CFU/mL 的菌悬液，在最佳免疫捕获条件下，参照方法1.2.2.1 进行捕获、磁分离。将阳性对照，IMB-菌悬液，废液以0.3、0.3、0.4mL 分别在Baird-Parker 平板铺盘，将涂布好的平板在37℃培养45～48h 后计数。

1.2.5 特异性实验 将均含有103CFU/mL 的金黄色葡萄球菌和福氏志贺氏菌的混合液加入到免疫磁珠中，同时作阳性对照，在室温下以15r/min 振荡孵育45min，磁分离1.5min 后，用PBS 清洗两遍，收集洗液，废液和洗液混合于1.5mL 离心管中，IMB-菌复合物重新分散在1.0mL PBS 中。将阳性对照，IMB-菌悬液，废液分别取100μL 同时在BP 平板和营养琼脂平板上涂布，37℃培养45～48h 后观察计数。

1.2.6 免疫磁分离食品样品中金黄色葡萄球菌 准确称取25g 冷冻羊肉卷，加入225mL 0.1%无菌PBS于三角瓶中，混合搅拌1min，收集洗水，各取9mL 洗水于无菌试管中，分别接入1mL 不同浓度的金黄色葡萄球菌悬液，选择菌液浓度在102和103CFU/mL的样品，同时作空白实验，按上述方法免疫磁捕获，BP 平板菌落计数。

2 结果与分析

2.1 免疫捕获金黄色葡萄球菌条件优化

2.1.1 多克隆抗体包被链霉亲和素磁珠加入量的优化选取 如图1 所示，当加入的抗体量在10～30μL时，随着抗体加入量的增加捕获效率增大，随后，随着抗体加入量增加捕获效率反而逐渐下降，并趋于平缓。原因是过量抗体的加入会导致空间阻碍和竞争，即便有更多数量的抗体附着在磁珠上，其连接的稳定程度远不如适量抗体与磁珠的结合，在接下来的磁珠分离和洗脱步骤中，结合不太紧的抗体会与磁珠再分离，导致捕获效率反而下降。可见添加的抗体量过多不仅不利于反应的进行，同时也造成抗体的浪费，故初选30μL 抗体加入量的免疫磁珠。

图1 多抗包被链霉亲和素磁珠加入量对金黄色葡萄球菌捕获效率的影响Fig.1 The effect of addition amount of antibody coating the magnetic beads on capture efficiency of SA

2.1.2 免疫磁珠加入量的优化选取 如图2 所示，随着免疫磁珠加入量增加，金黄色葡萄球菌捕获效率逐渐增大，当免疫磁珠加入量达到80μL 时，捕获效率达到相对最大，再继续增加捕获效率反而降低，可能是由于免疫磁珠过多后，细菌表面吸附的磁珠量增大，这样在强磁场下分离时造成部分细菌损伤，从而造成捕获效率有所下降，故初选用80μL 作为免疫磁珠的最佳加入量。

图2 免疫磁珠加入量对金黄色葡萄球菌捕获效率的影响Fig.2 The effect of addition amount of IMB on capture efficiency of SA

2.1.3 免疫捕获时间的优化选取 如图3 所示，免疫捕获时间在20 ～45min 时，捕获效率随时间延长增大，当捕获时间为45min 时，免疫磁珠对金黄色葡萄球菌的捕获效率相对最高，45～95min 之间捕获效率缓慢下降并趋于平缓。原因是免疫捕获时间过短，细菌与免疫磁珠结合不充分，造成免疫磁珠没有充分捕获到目标菌，或者细菌和磁珠结合的稳定程度还不高，在后续的磁珠分离、洗脱步骤中再分离，因而捕获效率较低，又由于整个反应过程始终是在振荡条件下进行的，反应时间过长则可能使部分细菌与磁珠脱离，捕获效率略有下降。因此，初选免疫捕获时间为45min。

图3 免疫捕获时间对金黄色葡萄球菌捕获效率的影响Fig.3 The effect of response time on capture efficiency of SA

2.1.4 免疫捕获的正交实验 根据单因素实验结果，选用L9(34)正交表，进行4 因素3 水平的正交实验(设一列空列)，实验结果见表2。

表2 正交实验极差分析结果Table 2 The results of range analysis to orthogonal test

从表2 可以看出，各因素的影响次序是A ＞C ＞B，即依次是抗体包被磁珠的加入量、免疫捕获时间和免疫磁珠加入量，同时，各因素的极差值均大于空列的极差值，说明各因素在实验范围内对实验均有明显影响。根据正交实验结果，得出最佳的免疫磁捕获条件为抗体包被磁珠加入量为30μL，免疫磁珠加入80μL，与菌液免疫捕获时间为45min。

2.2 免疫磁珠对不同浓度菌液的捕获

为了进一步验证最佳条件，同时检验免疫磁珠捕获效率的稳定性，在最佳免疫捕获条件下，对103、104、105、106CFU/mL 的菌液捕获效率如表3 所示。结果显示，免疫磁珠对103～106CFU/mL PBS 中的金黄色葡萄球菌捕获效率在33.50%到40.17%之间，捕获效率基本都高于正交表中的最优组合，说明优化出的条件可行。

同时，免疫磁珠对不同浓度菌液的捕获效率相对比较稳定，这为后期免疫磁珠分离技术和其他检测方法相结合定量检测，获得线性关系的标准曲线提供了基础。

表3 免疫磁珠对不同浓度金黄色葡萄球菌的捕获Table 3 The capture of IMB to different concentration SA in PBS

2.3 灵敏度实验

从表4 可以看出，这种免疫磁捕获金黄色葡萄球菌的方法可以捕获到101CFU/mL 浓度的菌液，表明该方法有较高的灵敏度。

表4 免疫磁珠捕获的灵敏度实验Table 4 The sensitivity of the capture of IMB

2.4 特异性实验

从表3 样品5 可以看出，金黄色葡萄球菌免疫磁珠对含有6.46 × 103CFU/mL 志贺氏菌，4.91 ×103CFU/mL 金黄色葡萄球菌的混合菌液捕获效率为33.02% ±4.59%，这与纯金黄色葡萄球菌菌液的捕获效率(34.84% ±6.84%)相近，表明志贺氏菌不会干扰免疫磁珠对金黄色葡萄球菌的捕获。

另外，从同时可以生长这两种菌的营养琼脂平板上观察菌落形态，免疫磁珠捕获的菌都为金黄色葡萄球菌，而志贺氏菌基本都留在了洗下的废液中，表明金黄色葡萄球菌免疫磁珠的特异性良好。

2.5 免疫磁分离食品样品中金黄色葡萄球菌

利用该方法对人工接入102、103CFU/mL 金黄色葡萄球菌的羊肉卷洗水样品免疫分离，捕获效率分别为19.35% ±3.38%和17.74% ±2.92%，空白样品中基本没有金黄色葡萄球菌，结果表明免疫磁珠可以对实际样品中的金黄色葡萄球菌捕获，但捕获效率有所降低，可能是由于样品中的一些蛋白质和抗体存在非特异性吸附，干扰了抗体对目标菌抗原的捕获。因此，需要进一步探索，如简单的样品预处理，来优化免疫磁分离应用在食品样品中目标菌的捕获。

免疫磁技术对目标菌快速捕获，捕获灵敏度高，为捕获后快速检测提供依据。目前，传统的平板计数方法操作繁琐，检测时间较长，不能满足快速检测的要求，而一些检测方法灵敏度较低，需进行增菌培养，如ELISA，乳胶凝集实验等，因此，利用纳米磁珠对食品中的检测目标高效捕获，再结合其他检测方法对其高灵敏地快速定量检测，是本研究的优势，也是最终目标。

3 结论

本研究利用生物素化的金黄色葡萄球菌多抗(4～5mg/mL)包被直径180nm 的链霉亲和素磁珠，制备免疫磁珠。通过实验设计，对免疫磁捕获过程中的若干影响因素进行了研究。

单因素和正交实验结果表明:在实验范围内，各因素影响金黄色葡萄球菌捕获效率的主次顺序为抗体包被磁珠加入量＞免疫捕获时间＞免疫磁珠加入量，最佳捕获条件为选用30μL 抗体加入量包被的磁珠，免疫磁珠加入80μL，免疫捕获45min，在此条件下，对103～106CFU/mL 的金黄色葡萄球菌捕获效率为33.50%～40.17%。同时，该方法具有良好的灵敏度和特异性，可初步用于食品样品中对金黄色葡萄球菌的免疫捕获和分离。

免疫磁捕获技术能与多种检测方法联用，如量子点荧光免疫方法，实时荧光PCR 方法等，实现对目标菌快速、准确的实时检测。本研究制备了金黄色葡萄球菌多抗免疫磁珠，快速、有效地对金黄色葡萄球菌捕获分离，捕获时间小于1h，为下一步实时检测提供了依据。

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