王长远，周 静

(黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江大庆163319)

蛋白酶是催化蛋白质和多肽水解的一类酶，种类很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。蛋白酶在工业用酶中非常广泛，约占整个酶制剂市场的60% 以上，广泛应用于食品、饲料、纺织和洗涤等领域［1］。豆豉源于我国，由黄豆和黑豆为原料，经微生物发酵制成的传统发酵食品，研究中发现参与细菌型豆豉发酵的微生物主要为豆豉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌与微球菌，并且发现这些菌在发酵过程中产生多种蛋白酶［2-3］。而微生物发酵法是生产蛋白酶的主要方法，因此提高微生物产酶能力和高产蛋白酶菌株的选育显得尤为重要。诱变育种是菌种选育研究中最常采用的技术手段，它不仅可以提高菌株的生产能力，而且还可以改进产品的质量，扩大品种，简化工艺［4］。本实验从市售豆豉中分离出产蛋白酶菌株，并采用紫外诱变方法进行选育，提高菌株的产蛋白酶能力，以期为后续实验提供高效菌株。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

豆豉 大庆市某超市购买;福林酚试剂 上海润捷化学试剂有限公司;酪氨酸 Sigma 公司;干酪素 上海润捷化学试剂有限公司;斜面培养基 营养琼脂45g，蒸馏水1000mL;种子培养基:蛋白胨10g，酵母浸膏5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL;分离培养基:干酪素5g，葡萄糖1g，酵母浸膏1g，磷酸氢二钾4g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.1g，琼脂粉20g，蒸馏水1000mL;发酵培养基:蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL。

752 紫外可见分光光度计 上海精密仪器厂;超净工作台 苏州净化设备厂;恒温水浴锅 余姚江南仪器厂;高压灭菌锅YX280B 上海三申医疗器械有限公司;电热恒温鼓风干燥箱DHG-9075A 上海齐欣科学仪器有限公司;电热恒温培养箱XMT-152C 重庆市永生实验仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种的分离 取1 粒豆豉放入10mL 的生理盐水中，在90℃水浴中加热6min，使豆豉中的杂菌被杀死，将菌液用10 倍梯度稀释法稀释后涂布于酪素培养基上，36℃下培养24h，选择能够产生透明圈的菌落。共设3 组平行实验。

1.2.2 菌种的初筛与复筛 将产生透明圈的菌株接种到基础培养基中，在36℃，170r/min 下振荡培养24h，将培养后的菌液进行梯度稀释后接种到酪素培养基中，在36℃下培养24h，选择透明圈直径与菌落直径的比值(HC 值)较大的菌落。

将初筛中透明圈直径与菌落直径比值大的菌株接种到肉汤培养基中，在36℃，170r/min 下振荡培养24h，将培养好的菌液于有肉汤培养基的50mL 三角瓶中，36℃下振荡培养48h，转速3500r/min 下离心30min，取上清液测定蛋白酶活力。

1.2.3 酶活力的测定 将复筛中选出的透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株用福林酚法测定蛋白酶活力［5］，选出产蛋白酶活力最高的菌株进行鉴定。

1.2.4 菌种的鉴定 按照实验的目的和要求进行菌种的初步鉴定。通过镜检观察菌种的形态与菌落特征，并进行生理生化鉴定［6-7］，1%葡萄糖琼脂、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、结晶糊精、苯丙氨酸、β-半乳糖苷酶、厌氧反应、山梨醇、明胶、硫化氢、赖氨酸脱羧酶、硝酸盐还原、尿素、蛋白胨水、石蕊牛奶等。

1.2.5 将筛选出的优势菌株制成单孢子悬液，取2mL 悬液到无菌培养皿中(同时制作7 份)，将培养皿放到磁力搅拌器上进行照射，磁力搅拌器离15W的紫外灯30cm，照射时间分别为0、60、120、180、240s。取0.1mL 照射后的菌液，涂布于平皿中，36℃下培养48h。观察结果，按下式计算存活率与致死率［8］，并以时间为横坐标、比活率(为存活率与致死率在不同诱变时间相对应的百分比数值)绘制菌株诱变曲线，确定最佳诱变时间。

存活率(%)=(处理后1mL 菌液中活菌数/对照1mL 菌液中活菌数)×100;

致死率(%)=(对照1mL 菌液中活菌数-处理后1mL 菌液中活菌数)/对照1mL 菌液中活菌数×100。

1.2.6 优良突变株的筛选 将诱变后的孢子悬液稀释，涂布于酪素培养基，36℃避光培养24h，从中选出透明圈直径与菌落直径比值大的菌株进行点种，再从点种菌落中初筛出透明圈直径与菌落直径比值(HC 值)最大的菌落，接种培养进行复筛，做3 个平行，发酵48h 测定发酵液中的蛋白酶酶活［9］。

2 结果与分析

2.1 菌种的分离、初筛和复筛结果

通过菌种的分离从中筛选出30 株产生透明圈的菌株，将其接种到基础培养基上经过初筛后得到16 株透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株，然后再接种到培养基中进行复筛，最后得到8 株透明圈直径与菌落直径比值大的菌株进行酶活力测定。

2.2 菌种复筛产蛋白酶菌株活力测定

通过福林酚法测定复筛后得到的8 个菌株的产蛋白酶活力结果如图1，得知菌株B 产生蛋白酶活力最高，为2360.80U/mL。

图1 产蛋白酶活力Fig.1 Curve of enzyme activity of protease

2.3 菌种鉴定

镜检观察为革兰氏阳性杆菌，细胞形态呈杆状、产生近中生椭圆状芽孢。在营养培养基上的菌落为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，有刺状，有一层薄膜，菌落上有大量粘液;在酪素培养基上产生透明圈，边缘整齐，白色，表面光滑;在肉汤培养基中长生薄膜，浑浊;生理生化结果见表1;根据实验结果初步鉴定为地衣芽孢杆菌。

表1 菌株的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of the strain

2.4 紫外诱变条件的选择

结果显示，菌株致死率随诱变时间延长而增大，当诱变时间超过120s 时，致死率相应上升，但存活率下降较大，由于低剂量处理能提高正突变率，负突变较多出现在偏高的剂量中，按照诱变后致死率在60%～70%时产生正突变的几率最高［8］，从而由图2知，诱变时间在120s 时，致死率为66.68%，因此诱变条件确定为距离15W 的紫外灯30cm，照射时间为120s。

2.5 优良突变株的筛选结果

图2 菌株紫外线诱变致死率曲线Fig.2 Curve of strain fatality rate after UV mutagenesis

菌株诱变后，在产生的44 个透明圈的菌株中，筛选出6 株透明圈直径与菌落直径比值(HC 值)较大的良突变株，测定酶活后得知B-14 号菌株酶活最高，酶活为2922.90U/mL，见图3。

图3 诱变后菌株产蛋白酶活力Fig.3 Curve of producing protease activity of the mutagenized strains

2.6 诱变菌株遗传稳定性

检测结果显示，B-14 菌株经5 次传代，其蛋白酶活力变化范围不超过10%，表现出比较稳定的产酶性能，表明菌株的遗传性能良好，见表2。

表2 诱变菌株遗传稳定性实验Table 2 Genetic stability test of mutagenized strains

3 结论

本实验对市售豆豉中筛选出的一株优良地衣芽孢杆菌进行酶活力测定，并进行紫外诱变。筛选出的产蛋白酶活力最高的菌株B，酶活力为2360.80U/mL，用生理生化方法进行鉴定后得知此菌株为地衣芽孢杆菌，并对这个菌株进行紫外诱变处理，诱变条件为15W 的紫外灯下照射120s，与紫外灯的垂直距离为30cm，诱变后测定酶活，比较后得到的菌株B-14 为优良菌株，酶活力为2922.90U/mL，连续传代5 次的酶活力变化不超过10%，表明该突变菌株遗传性稳定，为后续实验提供高效菌株。

在食品行业，蛋白质深加工占据了很大比例，曾经普遍使用的酸碱水解法因其存在食品安全和产品质量差等原因，使其产品在应用上受到很大的限制。随着生物技术和生物工程的应用和发展，以及纯天然无毒害的酶法生产，因为其具有天然无毒、不含氯丙醇，生产条件温和、成本低和产品质量好等优点，在各大生产厂家得到了广泛应用，目前我国蛋白酶产量仅占生物酶总量的7%～8%，与国外发达国家的15%～20%蛋白酶比例相比，有较大差距，因此，作为广谱性酶制剂，蛋白酶会有很大的市场发展空间。

［1］陈嵘，关珊珊，吴国忠，等.产蛋白酶毛霉菌株的初步筛选［J］.微生物学杂志，2008，28(1):101-104.

［2］Salvati S，Attorri L，Di Benedetto R，et al.Polyunsaturated fattyacids and neurological diseases［J］. Mini Reviews in Medicinal Chemistry，2006，6(11):1201-1211.

［3］李小永，陈伟，程芳，等.一株细菌型豆豉发酵菌种的筛选及鉴定［J］.食品工业科技，2011，32(11):212-215.

［4］鞠华伟，江连洲.高产碱性蛋白酶枯草芽孢杆菌菌株选育及其水解条件的研究［J］.食品工业科技，2007，28(8):109-111.

［5］诸葛健，王正祥.蛋白酶活力测定方法，工业微生物实验技术手册［M］.北京:中国轻工业出版社，1994:205-209.

［6］李林珂.蛋白酶产生菌的筛选及其ap 基因的克隆和表达［D］.郑州:河南农业大学，2006.

［7］马校卫，颜林春，汤二将，等.高温大曲中产耐热性蛋白酶芽孢杆菌的筛选和鉴定［J］.食品工业科技，2012，33(15):168-173.

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［9］陈宏军.蛋白酶高产菌株的紫外诱变选育［J］.安徽农业科学2010，38(3):1110-1111.