袁海晓，钟桂芳，樊 攀，魏东芝，杨雪鹏

(郑州轻工业学院，食品与生物工程学院，河南郑州450003)

脂肪酶(EC3.1.1.3，又称三酰基甘油水解酶)是一种特殊的酯键水解酶，它能在油水界面催化天然底物(油脂)水解，生产甘油和脂肪酸［1］。脂肪酶是一种重要的工业酶类，广泛应用于食品、洗涤、皮革、造纸、医药等行业［2］，尤其是该酶可以耐受有机溶剂，在有机合成中具有广泛的应用潜力［3］。我国微生物脂肪酶的研究和开发工作始于60 年代，但主要是中性脂肪酶，近年来随着环保意识的增强，无磷洗涤剂开始普及，碱性脂肪酶的研究逐渐成为热点［4］。脂肪酶来源于动物、植物和微生物，微生物脂肪酶比动植物脂肪酶更具有潜力和优势。据统计，自然界中有65 个属的微生物能产脂肪酶，报道的主要有黑曲霉、毛霉、假单胞菌等［5］。假单胞菌产的脂肪酶具有耐热、耐碱等特点，可在有机相中催化多种反应，应用潜力大［6］。本课题组筛到的一株产碱性脂肪酶的细菌经鉴定是假单胞菌，本文对已分离得到的BL11 菌株的产酶条件进行优化，以期为进一步研究碱性脂肪酶的发酵生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

假单胞菌BL11 由郑州轻工业学院食品与生物工程学院酶分子工程研究室保藏;种子培养基 酵母粉0.5%，蛋白胨1%，氯化钠1%，pH7.0;基础发酵培养基 麦芽糖1%，蛋白胨1%，K2HPO40.2%，pH7.5;蛋白胨，酵母粉，麦芽糖，K2HPO4等药品 均为分析纯。

SW-CJ-1F 型单人双面净化工作台 苏州净化设备有限公司;QYC211 全温空气摇床 上海福玛实验设备有限公司;HW-SY-K 系列电热恒温水浴锅

北京市长风仪器仪公司;UV-2600 紫外可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵培养及制备粗酶液 挑取BL11 单菌落接种于种子培养基，37℃，200r/min 振荡过夜后按2%接种量接种于发酵培养基，37℃，200r/min 培养48h 后，4℃、7000r/min 离心15min，收集发酵上清即为粗酶液。

1.2.2 酶活测定［7］本实验采用分光光度法测定脂肪酶酶活。以pH8.0，60℃条件下，每分钟分解底物(对硝基苯酚十二烷酸酯)释放1μmol 对硝基苯酚所需酶量定义为1 个碱性脂肪酶酶活力单位(U)，用U/mL 表示。

1.2.3 BL11 菌株产酶条件的优化

1.2.3.1 单因素实验 单因素条件包括碳源、氮源、诱导剂、无机盐、起始pH、装液量、温度、转速、发酵时间。所有实验均设置3 个平行，实验数据采用DPS统计学软件进行分析。

1.2.3.2 均匀设计 在单因素实验的基础上，采用均匀设计进一步优化培养基组成和培养条件。共选择4 个因素，每个因素设5 个水平，采用均匀设计表U5(54)优化(见表1)。其他培养条件为K2HPO40.2%，装液量 40mL/250mL 三角瓶，摇床转速180r/min，发酵时间60h。

表1 U5(54)均匀表Table 1 U5(54)uniform design table

2 结果与分析

2.1 单因素实验优化发酵参数

2.1.1 碳源对BL11 产酶的影响 考察葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、淀粉、糊精对BL11 产酶的影响。采用基础发酵培养基，分别选1%不同种类的碳源，37℃、200r/min 培养48h 后测定脂肪酶酶活。结果如图1，麦芽糖为碳源时酶活最高，故选用麦芽糖作碳源。进一步考察不同麦芽糖浓度对BL11 产酶的影响，结果见图2 所示，当麦芽糖浓度为1%时，脂肪酶酶活最高。

图1 碳源对BL11 产酶的影响Fig.1 Effect of carbon sources on lipase production produced by BL11

2.1.2 氮源对BL11 产酶的影响 以1%麦芽糖为唯一碳源，选用牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、NaNO3、尿素、(NH4)2SO4为氮源，其他营养成分同前，实验结果如图3 所示，选用蛋白胨时酶活达到最高，进一步优化其浓度，结果如图4 所示，当其浓度为2%时，脂肪酶酶活最高。

图2 麦芽糖浓度对BL11 产酶的影响Fig.2 Effect of maltose concentration on lipase production produced by BL11

图3 氮源对BL11 产酶的影响Fig.3 Effect of nitrogen sources on lipase production produced by BL11

图4 蛋白胨浓度对BL11 产酶的影响Fig.4 Effect of nitrogen concentration on lipase production produced by BL11

2.1.3 诱导剂对BL11 产酶的影响 向部分优化培养基中添加0.2%橄榄油、豆油、花生油、玉米油和葵花籽油考察诱导剂对BL11 产酶的影响。结果如图5所示，不同种类的诱导剂均可以不同程度地提高酶活。考察豆油浓度对产酶的影响，结果如图6 所示，当豆油浓度为0.2%时，BL11 菌株的产酶情况最佳，故选用0.2%豆油作为诱导剂。

2.1.4 无机盐离子对BL11 产酶的影响 向发酵培养基中添加0.2%不同种类的无机盐，其对BL11 产酶的影响见图7。从图7 可看出，与对照(不添加任何盐)相比，只有K+可促进产酶;进一步优化其最适产酶浓度，从图8 可知，当K2HPO4浓度为0.2%时，BL11 产酶能力达到最佳。

2.1.5 起始pH 对BL11 产酶的影响 配制不同起始pH(6～9)的发酵培养基，37℃、200r/min 发酵48h 后测脂肪酶酶活。由图9 可知，BL11 菌株的最适产酶pH为7.5，较接近中性，pH 偏酸偏见都不利于其产酶。

图5 诱导剂对BL11 产酶的影响Fig.5 Effect of inducers on lipase production produced by BL11

图6 豆油浓度对BL11 产酶的影响Fig.6 Effect of soybean oil concentration on lipase production produced by BL11

图7 无机盐对BL11 产酶的影响Fig.7 Effect of inorganic salts on lipase production produced by BL11

图8 K2HPO4 浓度对BL11 产酶的影响Fig.8 Effect of K2HPO4 concentration on lipase production produced by BL11

图9 起始pH 对BL11 产酶的影响Fig.9 Effect of initial pH on lipase production produced by BL11

2.1.6 装液量(溶氧)对BL11 产酶的影响 装液量反映了菌株对溶氧的要求，溶氧对BL11 产酶的影响见图10。从图10 可知，装液量为20mL/250mL 时酶活达到最高，装液量为20、30、40mL/250mL 时酶活相差无几，考虑培养基的利用效率，装液量采用40mL/250mL。

图10 装液量对BL11 产酶的影响Fig.10 Effect of loaded liquid on lipase production produced by BL11

2.1.7 温度对BL11 产酶的影响 选取26、28、30、32、34、37℃不同温度，200r/min 培养48h 后测定酶活。结果见图11 所示，BL11 在30℃培养时脂肪酶酶活达到最大。

图11 温度对BL11 产酶的影响Fig.11 Effect of temperature on lipase production produced by BL11

2.1.8 转速对BL11 产酶的影响 BL11 菌株发酵培养摇床转速分别设置为160、180、200、220r/min，30℃培养48h 后测定酶活，从图12 可知，当摇床转速为180r/min 时，BL11 菌株所产脂肪酶酶活达到最大。

2.1.9 培养时间对BL11 产酶的影响(产酶曲线)BL11 菌株产酶曲线如图13 所示，随着发酵时间延长，BL11 菌产脂肪酶酶活也呈现先升后降的趋势，当发酵时间为60h 时，脂肪酶酶活达到最大。

图12 转速对BL11 产酶的影响Fig.12 Effect of rotate speed on lipase production produced by BL11

图13 发酵时间对BL11 产酶的影响Fig.13 Effect of fermentation time on lipase production produced by BL11

2.2 均匀设计优化发酵参数

利用单因素方差分析法分析上述实验结果，按其对BL11 产酶影响的显著性进行排序。选取影响产酶显著的四个因素进行均匀设计优化发酵参数。选取的四个因素为麦芽糖、蛋白胨、豆油、温度，每个因素取5 个水平，选用均匀实验表U5(54)进行实验，结果见表2。

表2 均匀实验结果Table 2 the result of uniform design

通过DPS 软件回归分析，得到酶活大小(Y)与各因素(X)之间的关系方程为

Y =217.02 +1.99X1-266.2X2+84X22，相关系数R =0.9998，F =982.1788，p =0.0235。

各因素的最佳组合为:麦芽糖2.5%，蛋白胨3.0%，豆油0.5%，温度33℃，理论酶活可达到228.28 U/mL。根据DPS 软件回归分析的结果，进行验证实验，发酵上清最终酶活为223U/mL，略低于理论值。

3 结论与讨论

通过单因素实验和均匀设计相结合的方法获得了假单胞菌BL11 菌株液体发酵最佳培养基配方和培养条件。最佳培养基配方为:麦芽糖2.5%，蛋白胨3.0%，豆油0.5%，K2HPO40.2%;培养条件为起始pH7.5，装液量40mL/250mL 三角瓶，培养温度33℃，摇床转速180r/min。在该培养基和培养条件下，振荡培养60h，脂肪酶活力可达223U/mL。通过均匀设计优化后酶活较之单因素实验最大酶活提高了30%，较大地提高了酶活且简化了实验。

脂肪酶活力测定方法主要有滴定法、对硝基苯酚法和铜皂法，对硝基苯酚法比滴定法结果稳定、重复性好，比铜皂法安全且用时短，是快速测定脂肪酶活力的较好选择。

不同油脂作为诱导剂均可使假单胞菌BL11 产酶酶活有不同程度地提高，六种油脂中以豆油的效果最佳。

［1］唐芸，宋庆训，李晓敦，等.十二节杆菌胞外脂肪酶的纯化和性质研究［J］.工业微生物，2007，37(4):45-49.

［2］周秀琴.微生物脂肪酶的生产及应用［J］.发酵科技通讯，2009，38(3):55-56.

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