马 萌，周惠明 ，朱科学，彭 伟

(江南大学食品学院，江苏无锡214122)

菱角在我国有2000 多年的栽培历史，原产于我国南方，现已扩种至北京、天津一带，但以长江下游和珠江三角洲以及山东内湖等地载培较为集中，每年的菱角种植面积约为40000m2，年产量超过24 万t［1］。菱角的药用价值较高［2］，关于菱角的药理功能已有很多报道，主要集中在菱角壳药用成分的提取分离和应用。由于菱角生长速度快且产量高，因此每年会产出大量的菱角，但除了用作药用成分提取，少量被栽培区人们直接食用外，菱角肉的消费量很低，带来巨大的资源浪费。由于菱角肉中的主要成分是淀粉和蛋白，淀粉含量在80%左右，蛋白含量在10%以上，而目前国内外对菱角的研究主要集中在菱角壳中药用成分的抗癌作用［3］和不同地域的菱角淀粉基本性质的研究［4-7］，关于菱角淀粉与蛋白分离精制的研究相对较少，尤其在菱角蛋白的研究上目前尚未见报道。如果能将菱角中的淀粉和蛋白充分提取并研究其特性，对菱角的综合利用和附加值的提高将会有重要的意义。由于前期预实验发现菱角蛋白水溶性好，多为可溶性蛋白，根据这一特性，本研究借助物理分离方法对菱角粉中的蛋白和淀粉进行分离，制备食品级菱角淀粉和菱角蛋白，并对其基本性质进行了初步分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菱角肉 山东省微山县湖产品加工总厂，去皮晒干后的初成品;马铃薯淀粉、玉米淀粉 国民淀粉;无水乙醇、氢氧化钠、乙酸、碘化钾、碘 AR，国药集团化学试剂有限公司。

电子分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;HH-6 数显恒温水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;电热恒温鼓风干燥箱 上海跃进医疗器械厂;胶体磨 无锡赫普轻工设备有限公司;UV-2800 型紫外可见分光光度计 上海分析仪器厂;RJ-LDL-50G 低速大容量多管离心机 江苏无锡瑞江离心机厂;D8 Advance 型X-射线衍射仪 德国Bruker AXS 公司;Mastersize 2000 激光衍射粒度分析仪 英国马尔文仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菱角肉基本成分测定 食品中水分测定GB5009.3-2010;油脂含量测定GB/T5009.3-2003;蛋白含量测定GB5009.5 -2010;灰分含量测定GB 5009.4-2010;淀粉含量测定GB/T5009.9-2008;纤维含量测定GB/T5009.10-2003。

1.2.2 菱角淀粉和蛋白的制备［8-10］原料是新鲜菱角去皮晒干后的初成品，称取0.5kg，清洗浸泡后，采用粉碎机粗磨，然后用胶体磨细粉碎一定时间，乳浆过100 目筛去除纤维等杂质，得到的淀粉乳用清水浸泡一定时间，收集上层液，以5000r/min 离心20min。淀粉沉淀55℃烘箱干燥12h 后过100 目筛，收集淀粉密封保存;蛋白溶液通过低温浓缩和喷雾干燥制得菱角蛋白。

图1 菱角淀粉和菱角蛋白制备工艺流程图Fig.1 The preparation process flow diagram of the Water caltrop starch and protein

1.2.3 单因素实验 在浸泡时间6h，5000r/min 离心20min 条件下，粉碎时间(5、10、15、20、25、30、35s)对分离效果的影响情况;在粉碎时间20s，5000r/min 离心20min 条件下，不同浸泡时间(2、4、6、8、10、12、14h)对分离效果的影响情况;在粉碎时间25s，浸泡时间8h，5000r/min 离心分离条件下，离心分离时间(5、10、15、20、25、30、35min)对分离效果的影响情况。

1.2.4 正交实验 根据单因素实验结果，设计三因素三水平正交实验，正交实验设计表见表1。

表1 正交实验设计表Table 1 The design table of orthogonal tests

1.2.5 淀粉提取率的计算 根据公式计算淀粉提取率(%)=M1/M2×100

式中:M1为100g 的原料经提取所能得到的最终产品菱角淀粉的干重;M2为100g 原料中淀粉的质量。

1.2.6 淀粉颗粒粒度分布和直链淀粉含量的测定［11］采用Microtrac S3500 型激光粒度分析仪来测定样品的粒径分布。测定范围0.020～2000μm，数据采用Microtrac S3500 相关软件分析。

直链淀粉含量的测定采用碘比色法［12］。

1.2.7 淀粉结晶特性的测定 采用Bruker D8 X-射线衍射仪进行测定，测定条件如下:特征射线Cu 靶，电压为40kV，电流为40mA，起始角度3°，终止角度60°，步长0.02°，扫描速度为4°/min，发散狭缝1mm，防发散狭缝1mm，接受狭缝0.1mm，根据得到的X 射线衍射图谱参照Komiya 和Nara 的方法［13］计算结晶度。

1.2.8 SDS-PAGE 凝胶电泳 参照Laemmli［14］，朱科学［15］等人的方法，电泳仪为DYY-6B 型稳压稳流电泳仪。分离胶浓度为10%，浓缩胶浓度为5%，电泳稳压100V 操作。采用鸡蛋清溶菌酶(14.4ku)、胰蛋白酶抑制剂(20.1ku)、牛碳酸酐酶(31.0ku)、兔肌动蛋白(43.0ku)、牛血清白蛋白(66.2ku 和兔磷酸化酶B(97.4ku)作为相对分子质量标准。溴酚蓝为指示剂，其迁移率为1.0。根据标准蛋白分子量与其相对迁移率的关系作标准曲线，通过标准曲线确定样品中蛋白组分的分子量。

2 结果与讨论

2.1 菱角肉基本成分测定结果

从表2 中可以看出，菱角肉中的主要成分是淀粉和蛋白，其中淀粉含量为78.99%，占菱角肉的主要部分，蛋白含量也很丰富，达到15.86%，粗脂肪含量很少，不到1%，其它成分含量同样很少。由此可以推测，菱角肉中可利用度最高的成分是菱角淀粉和菱角蛋白，而对菱角肉加工品质影响最大的同样是其中含量最高的淀粉和蛋白。

表2 菱角肉基本成分测定结果(干基)Table 2 Basic components of Water caltrop

2.2 粉碎时间对菱角淀粉分离效果的影响

由图2 可知，随着粉碎时间的延长，菱角淀粉得率呈现先上升后下降趋势，在粉碎时间为20s 时提取率最高为93.15%;而菱角淀粉中蛋白含量则随着粉碎时间的延长呈现先降低后上升的趋势，当粉碎时间为15s 时，菱角淀粉中的蛋白含量最低为0.37%。由图3 可知，菱角蛋白含量随着粉碎时间的延长呈现先增加后下降趋势，当粉碎时间为20s 时，蛋白纯度可到最高，为94.32%。综合分析，粉碎时间在15～25s之间，菱角淀粉得率最高，淀粉中蛋白含量最低，菱角蛋白纯度可达最高，菱角淀粉和蛋白的分离效果最佳。

图2 粉碎时间对菱角淀粉品质的影响Fig.2 Effect of grinding time on the quality of water caltrop starch

2.3 浸泡时间对菱角淀粉分离效果的影响

图3 粉碎时间对菱角蛋白纯度的影响Fig.3 Effect of grinding time on the purity of water caltrop protein

由图4 可知，随浸泡时间的延长，菱角淀粉提取率和淀粉中蛋白含量均呈现逐渐降低的趋势。当浸泡时间为4h 时，菱角淀粉提取率的下降趋势基本趋于平缓，此时淀粉提取率为91.12%;当浸泡时间为8h 时，淀粉中蛋白含量低于0.5%且趋于稳定，此时为0.42%。由图5 可知，菱角蛋白的纯度随浸泡时间的延长逐渐升高，在浸泡8h 时趋于稳定，在12h 时达到最大值为93.13%。综合分析，浸泡时间在8h 时，菱角淀粉提取率和淀粉中蛋白含量趋于稳定，淀粉中蛋白含量达到要求，而蛋白纯度基本达到最大值。

图4 浸泡时间对菱角淀粉品质的影响Fig.4 Effect of soak time on the quality of water caltrop starch

图5 浸泡时间对菱角蛋白纯度的影响Fig.5 Effect of soak time on the purity of water caltrop protein

2.4 离心分离时间对分离效果的影响

由图6 可知，随着离心分离时间的延长，淀粉得率逐渐上升，淀粉中蛋白含量也呈现缓慢增加的趋势。当离心分离25min 时，淀粉提取率基本稳定为93.23%;淀粉中蛋白含量基本稳定，当分离时间大于35min 时，蛋白含量高于0.5%。由图7 可知，随着离心分离时间的延长，菱角蛋白纯度逐渐升高，在25min 时趋于最大值，为93.57%。综合分析，离心分离时间选在20～30min 之间，菱角淀粉和蛋白分离效果和纯度达到最佳。

图6 离心分离时间对菱角淀粉品质的影响Fig.6 Effect of centrifugal separation time on the quality of water caltrop starch

图7 离心分离时间对菱角蛋白纯度的影响Fig.7 Effect of centrifugal separation time on the purity of water caltrop protein

2.5 正交实验结果

正交实验结果分析可得(表3):菱角淀粉得率较优组合为A2B1C2，菱角淀粉提取率为92.1%;菱角蛋白纯度较优组合为A2B2C2;通过极差分析，正交实验中三个工艺参数对菱角蛋白纯度的影响浮动程度较大，而对菱角淀粉的提取率影响相对较小，因此重点分析各因素水平对菱角蛋白纯度的影响。由于菱角蛋白制备工艺较优组合未在正交设计实验中出现，所以需要对较优组合进行验证实验。

由正交实验验证结果可得(表4)，较优组合A2B2C2并不是菱角蛋白纯度最高的最优组合，A2B2C3为最优组合。最优组合工艺条件为:粉碎时间20s，浸泡时间8h，离心分离时间30min，该条件下菱角蛋白纯度为93.9%，菱角淀粉提取率为91.8%。

2.6 菱角淀粉颗粒粒度分布及直链淀粉含量

菱角直链淀粉含量17.11%，介于马铃薯淀粉和玉米淀粉之间。淀粉中直链淀粉和支链淀粉的含量对淀粉的糊化温度、溶解度、粘度等性质均有影响。菱角中直链淀粉含量较高。

菱角淀粉80%的颗粒粒径在15.52～26.88μm 之间，比马铃薯淀粉和玉米淀粉的粒径都小。淀粉颗粒的大小直接影响到淀粉的结晶性质，直链与支链淀粉的比例，糊化性质，流变学性质，消化性质，改性效果以及热力学性质等［16］。

表3 正交实验结果Table 3 Results of orthogonal experiments

表4 正交实验较优组合验证结果Table 4 Validation results of the optimum combination

2.7 菱角淀粉结晶特性

从图8 可以得出，马铃薯淀粉属于典型的B 型淀粉，在2θ 为5.6°、17.1°、22.1°和24.1°左右均有明显衍射峰，而菱角淀粉与玉米淀粉相同，在2θ 为15.2°、17.1°、18°和23.1°左右有明显衍射峰，且衍射峰强度强，属于A 型高结晶型淀粉，在特征峰处菱角淀粉的衍射强度大于玉米淀粉。基于Komiya 和Nara 的方法计算结晶度得出，菱角淀粉的结晶度(36.47%)大于马铃薯淀粉(29.88%)和玉米淀粉(34.34%)。

图8 淀粉的X-射线衍射图谱Fig.8 X-ray diffraction patterns of starches

2.8 菱角蛋白分子量分布

对菱角蛋白的分子量进行了分析(见图9)。泳道1 是标准分子量蛋白，泳道2 是菱角蛋白。

由图9 可见，菱角蛋白经过电泳后主要得到7 条区带，分子量分别为:14.5、17.5、19.0、22.5、37.2、45.8、68.2ku，且主要分布在17.5 与37.2ku 左右。由此可以看出，菱角蛋白多为小分子蛋白，分子量较小。

图9 菱角蛋白的SDS-PAGE 电泳图谱Fig.9 SDS-PAGE patterns of water caltrop protein

3 结论

本研究对菱角中的主要成分进行了分析，并且采用物理方法，将菱角中的主要成分淀粉和蛋白充分分离利用，确定了菱角淀粉和菱角蛋白分离提取的最优工艺条件:粉碎时间为20s，浸泡时间为8h，离心分离时间为30min。该条件下菱角淀粉提取率为91.8%，菱角蛋白纯度为93.9%。初步研究了淀粉和蛋白的基本性质，得出:菱角淀粉体积平均粒径为20.86μm，结晶度为36.47%，属于A 型淀粉;菱角蛋白的分子量主要分布在17.5、37.2ku 左右，为菱角资源的综合利用提供了基础数据。

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