陈凤清，丛建民 ，杜站宇，姚 娜，娄 雪

(白城师范学院，吉林白城137000)

黑豆(Glycine max var)又名橹豆、料豆、零乌豆，呈卵圆形或球形，表皮黑色或深绿色，全国各地均有生产，以东北产量最多。黑豆的蛋白质含量尤为丰富，高于肉类、鸡蛋和牛奶，素有“植物蛋白之王”的美誉［1］。黑豆芽具有黑豆所具有的各种营养成分，黑豆在发芽后更利于人体吸收各种营养物质。植物种子发芽时细胞内部代谢作用和酶的活性开始启动，使各种内含物质悄悄转变为溶解状态，以利水解作用进行。黑豆在发芽后更利于人体吸收其中各种营养物质。黑豆富含人体所需的氨基酸、维生素和微量元素等，具有健身滋补、扶正防病、延年益寿等作用［2］，作为药、食材料广泛种植。黑豆芽具有黑豆所具有的各种营养成分，丰富的蛋白质、脂肪、维生素、碳水化合物和膳食纤维、微量元素，并且含有丰富的维生素A、E，核黄素、黑色素等。种子萌发过程中，启动等一系列相关的生理生化变化来适应新的环境，并与其发育相关［3-4］。有关发芽黑豆的生理生化指标的研究鲜有报道，本文通过研究黑豆种子和发芽后酶的活力、功能成分与萌发时间的关系，旨在为进一步研究黑豆发芽发育生理状态与其营养变化及合理利用黑豆提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑豆 吉林省白城市洮南金祥乡;所用生化试剂 Sigma 公司的产品，其它试剂为分析纯。

FA1004A 精密电子天平 上海精天电子仪器有限公司;T6 紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;Anke GL-20B 飞鸽牌系列高速低温离心机 上海安亭科学仪器厂;SPX-250C 恒温恒湿培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;NO.10014，SIGMA 1-14 小型台式离心机 德国希格玛离心机有限公司。

1.2 实验方法

选取饱满、无病虫害的黑豆种子称重后，用25℃水浸泡，于恒温恒湿培养箱中25℃、400LX、75%湿度培养，并定时换水，按一定时间取样，取样后用FA1004A 电子分析天平称重并记录。每组做三个重复，未萌发的黑豆种子(CK)做对照。黑豆萌发后，分别在不同时间取材，检测各种生理生化指标。

1.2.1 蛋白质含量测定 参照考马斯亮蓝法［5］，以牛血清白蛋白为标准品制作标准曲线。

1.2.2 可溶性多糖含量测定 参照蒽酮法［6］，以葡萄糖为标准品制作标准曲线。

1.2.3 黑豆中多酚的提取及含量测定 参照茶多酚国家标准［7］。

1.2.4 黑豆中抗氧化酶系的提取及活力测定［8-9］过氧化氢酶(CAT)，超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化物酶(POD)，多酚氧化酶(PPO)活力测定。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

葡萄糖标准曲线:在488nm 处测反应体系的吸光值，得到葡萄糖浓度C 与吸光值A488的回归方程:

C =20.18A488-0.09(μg/mL)，r =0.9996，说明C与A488的线性关系良好。

蛋白质标准曲线:在595nm 处测反应体系的吸光值，蛋白质浓度C 与吸光值A595的得到回归方程:

C(μg/mL)=27.126A595-0.2825，r =0.9972，说明C 与A595线性关系良好。

2.2 可溶性蛋白质含量

黑豆发芽过程中，可溶性蛋白质含量变化见图1。

图1 可溶性蛋白质含量随萌发时间变化Fig.1 Changes of solubility protein content with germination time

从图1 可见，黑豆中可溶性蛋白含量在干种子中含量最低，当萌发12～60h 时，可溶性蛋白含量呈上升趋势，当发芽60h 时，含量最高，达到134.00mg/g DW;之后趋于稳定。黑豆发芽过程中吸水膨胀后，代谢活力加强，蛋白质从非可溶性状态转变为可溶性状态，其转化的可溶性蛋白可为萌发提供各种酶及可利用的各种活性氨基酸等代谢需要［10］。

2.3 可溶性多糖含量

由图2 可知，在黑豆未萌发时，碳水化合物主要以非可溶性多糖状态存在，可溶性多糖含量相对较低，可溶性多糖含量为48.75mg/g DW，在12h 时达到最大值77.47mg/g DW，之后缓慢降低，与种子多糖含量相近。随萌发时间的延长，作为种子中的贮藏物质，碳水化合物在酶的作用下，为生物体提供能量，并为萌发代谢提供基本材料。表现为种子中非可溶性多糖逐步转化为可溶性多糖，整体上多糖总量在减少，干物质量在减少［11］。

图2 可溶性多糖含量随萌发时间变化Fig.2 Changes of of soluble polysaccharide content with germination time

2.4 多酚含量

多酚是在植物性食物中发现的、具有潜在促进健康作用的化合物。豆芽暴露在空气中容易发生褐化，这是豆芽中的多酚物质与空气中的氧发生氧化作用的结果，酚类物质变为相应的醌类，在有氧状态下发生褐化作用。由图3 可知，在萌发12、60h 时，多酚含量出现两个高峰，在12h 前多酚含量增加，而在12～36h 多酚含量略有降低，在36～60h 时，多酚含量增加幅度大于12h 前，在60h 达到最高峰1.91mg/g DW;当萌发60h 后，多酚含量减少。

图3 多酚含量随萌发时间变化图Fig.3 Change of polyphenol content with germination time

2.5 酶活力测定结果及分析

2.5.1 CAT 比活力 由图4 可知，在培养12h 时，CAT 比活力表现相对较强，为35.56U/g Pr。在24～72h 中CAT 比活力相对较低，在24h 后随着培养时间的延长，CAT 比活力有增强趋势。CAT 比活力在12h 高，可能与种子吸水膨胀后呼吸强度相对增强相关，而在24h 后比活力增强，可能在发芽发育启动后，与代谢环境相关。CAT 是关系植物保护反应的关键酶，在发育代谢中对于清除种子内过多电子传递体系中过氧化氢自由基等，减轻生物膜损伤，维持自由基含量的相对稳定，保证正常生长具有重要作用［12-13］。

图4 CAT 比活力随萌发时间变化Fig.4 Specific activity of CAT with germination time

2.5.2 SOD 比活力 生物在生长条件下，会产生活性氧胁迫，活性氧的累积主要是由大量的超氧自由基所致，超氧自由基可通过酶促反应歧化生成H2O2和O2，或产生氧化活性更强的羟基自由基(·OH)，对于清除超氧自由基起关键作用的是SOD［14］。

由图5 可知，随着萌发时间的延长，SOD 比活先增加后降低，并在48h 后随着培养时间的延长而明显减弱，并低于种子中SOD 酶比活力。在干种子中SOD 比活力为85.88U/g Pr，在萌发24h 时，SOD 比活力最强为299.33U/g Pr，之后随着萌发时间的延长，SOD 比活力有所减弱，72h 时SOD 比活力为83.44U/g Pr。

图5 SOD 比活力随萌发时间变化Fig.5 Specific activity of SOD with germination time

2.5.3 POD 比活力 黑豆萌发过程中代谢产生如过氧化氢、酚类和胺类化合物等对机体有毒性的化合物及某些杂环化合物，对机体是具有损伤的，通过自身的过氧化物酶的活性来消除过多的过氧化物的损害，维持机体正常代谢［15］。植物在吸水后生长代谢初期产生大量的过氧化物，POD 催化对生物自身有毒害的过氧化物的氧化和分解，以维持自身的正常代谢，从而诱导了POD 活性的增加［16］。由图6 可知，随黑豆发芽时间延长，POD 活性发生改变。在种子中POD 比活力为6.35U/g Pr，在12h 时达到最高，为67.98U/g Pr，之后比活力下降，72h 时POD 比活力为20.28U/g Pr。

图6 POD 比活力随萌发时间变化Fig.6 Specific activity of POD with germination time

2.5.4 PPO 比活力 黑豆在萌发过程中多酚氧化酶比活力发生改变，是其发育中多酚物质在不同时期下发生变化相适应的结果。由图7 可知，PPO 比活力在种子中为21.00U/g Pr，培养12h 时最强为64.09U/g Pr，之后随着培养时间的延长，PPO 比活力有所减弱，72h 时PPO 比活力为9.47U/g Pr。发芽黑豆在培养了36h 后，PPO 比活力比对照降低。

图7 PPO 比活力随萌发时间与变化Fig.7 Specific activity of PPO with germination time

3 结论与讨论

3.1 黑豆中含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素、微量元素和粗纤维，具有高蛋白、低热量的特性，其中蛋白质含量达40%以上，黑豆蛋白质中的必需氨基酸组成结构水平总体优于黄豆，具体的每一种必需氨基酸含量均高于鸡蛋，居豆类之首;脂肪含量也高达15.19%，组成脂肪的脂肪酸以不饱和为主。黑豆中微量元素如锌、铜、镁、硒、磷等的含量都很高，并且含丰富的VA、VE、核黄素、黑色素等多种维生素［17］。黑豆皮质厚，不易消化吸收和利用，通过发芽技术改善黑豆的质构、营养、生物活性以及人体实际利用率已成为研究热点。孙肖青等［18］研究发现黑豆萌发后其游离异黄酮苷元成分增加，王薇等［19］发现萌发不同萌发时期内VC含量增加，翟玮玮等［20］发现发芽过程中蛋白质、必需氨基酸和非必需氨基酸的含量增加显著，内源蛋白酶活力先增加后降低;蛋白质平均相对分子质量显著下降;γ-氨基丁酸含量显著增加。

3.2 种子萌发吸取一定量的水分后，细胞内部代谢作用和酶的活性开始启动，使种子内含物质悄悄转变为溶解状态，以利水解作用进行［12］。黑豆种子萌发后细胞内启动相同的生理作用。本文通过研究发芽黑豆的可溶性蛋白、可溶性多糖、多酚含量变化，发现在种子中可溶性蛋白含量最低;在萌发12～60h内，随萌发时间延长，可溶性蛋白含量上升;在发芽60h 时达到最高，134.00mg/g DW。可溶性多糖含量在黑豆未萌发时为 48.75mg/g DW，在 12h 为77.47mg/g DW，达到最大值，之后缓慢降低。多酚含量在萌发12、60h 内出现两个高峰，在萌发36 ～60h内，多酚含量增加幅度大于12h 内的多酚增加量;在60h 达到最高峰，为1.91mg/g DW，在60h 后，多酚含量减少。

3.3 生物种子萌发时，其贮藏物质的分解与新器官中结构物质合成，均需靠酶的催化作用［12］。检测黑豆及萌发期的几种酶比活力发现CAT 比活力在培养12h 中表现相对较高活力，为35.56U/g Pr，24～72h 活力相对逐渐增加;在萌发24h 时，SOD 比活力最强，为299.33U/g Pr，之后随着萌发时间的延长，SOD 比活力有所减弱;POD 酶比活力在12h 时达到最高，为67.98U/g Pr，之后POD 比活力下降:PPO 比活力在萌发12h 时最强，为64.09U/g Pr，之后随着萌发时间的延长，PPO 比活力有所减弱。

［1］刘学军，苗以农，许守民，等.黑大豆中过氧化物酶和超氧物歧化酶活性的初步研究［J］.东北师大学报:自然科学版，1996，4:65-68.

［2］尹召军，陈卫平，张凤英.细菌型豆豉生理活性物质的研究进展［J］.中国粮油学报，2011，26(3):119-123，128.

［3］Bowler C，Van Montagu M，Inze D.Superoxide dismutase and stress tolerance ［J］.Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，1992，43:83-116.

［4］Pallitt K E，Young A J Carotenoids Alseher R G，Hess J I.Antioxidants in Higher Plants［J］.Boca Raton:CRC Press，1992，59-60.

［5］Marion M Bradford.A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the principle of Protein-Dye Binding ［J］.Analytical Biochemisry，1976，72:248-254.

［6］李合生.现代植物生理学［M］.北京:高等教育出版社，2000.

［7］GB/T 8314-2002，茶多酚测定［S］.

［8］刘鹏，杨玉爱.钼、硼对大豆叶片膜脂过氧化及体内保护系统的影响［J］.植物学报，2000，42(5):461-466.

［9］丛建民，沈海龙，李玉花，等.水曲柳体胚发生过程中不同状态类型外植体的生理生化状态［J］.华南农业大学学报，2012，33(1):48-52.

［10］刘娟，史晓媛，王庆南，等.玉米发芽过程中碳水化合物代谢变化的研究［J］.食品科学，2011，32(11):97-102.

［11］Buege，J A Aust，S D Microsomal lipid peroxidation methods［J］.Enzymol，1978，52:302-310.

［12］胡文权，植物种子萌发生理生化变化［J］.蔬菜，1999，12:37

［13］孙园园，孙永健，王明田，等.种子引发对水分胁迫下水稻发芽及幼苗生理性状的影响［J］.作物学报，2010，36(11):1931-1940.

［14］Mc Cord J M，Fridovich I.Journal of Biological Chemistry［J］，1969，244:6049-6055.

［15］王趁趁，丁超，唐蕾，等.忠贵芥蓝叶片过氧化物酶稳定性的研究［J］.食品工业科技，2012，33(3):70-71，312.

［16］CHEN Min，YAO Shanjing，ZHANG Hong，et al.Purification and Characterization of a Versatile Peroxidase from Edible Mushroom Pleurotus eryngii. ［J］ . Biotechnology and Bioengineering·Chinese Journal of Chemical Engineering，2010，18(5):824-829.

［17］丛建民.黑豆的营养成分分析研究［J］.食品工业科技，2008，29(4):262-264，268.

［18］孙肖青，孙筱林.黑豆萌发期游离异黄酮苷元成分的测定［J］.山东农业科学，2008，8:110-111.

［19］王薇，朱庆珍.黑豆不同发芽期VC变化规律研究［J］.农产品加工(学刊)，2011，259(10):49-50，56.

［20］翟玮玮，焦宇知.黑豆发芽过程中蛋白质及γ-氨基丁酸的变化及发芽条件的优化［J］.食品科学，2009，30(19):51-54.