汤 彬，薛 平，李 祥 ，陈建伟，邱海龙，张奉苏

(南京中医药大学药学院，江苏南京210046)

南方红豆杉别名美丽红豆杉、红榧、红叶水杉、海罗松、矮杉，是中国所特有的红豆杉科红豆杉属植物。国家Ⅰ级重点保护野生植物，其幼嫩枝叶和种子都可作药用。药用南方红豆杉幼嫩枝叶，性味苦，平;民间也有用于治疗糖尿病［1］。《中药大辞典》、《本草纲目》、《中华药海》中记载:红豆杉有利尿、通经、降血脂作用，对肾病、恶性肿瘤、高血压、高血脂症、糖尿病有独特疗效。近些年对红豆杉资源的利用主要集中在紫杉烷类物质上，对其中其他类活性成分如黄酮类、木质素类、糖苷类、酚酸类和多糖等［2-4］研究很少。近年来，大量研究表明，多糖除了有增强免疫力、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、消化系统保护作用的生物学活性外，还有抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗辐射、抗凝血等作用［5-7］。东北红豆杉多糖具有降血糖活性［8］，而对南方红豆杉多糖的研究很少。本文对南方红豆杉枝叶中活性多糖进行了含量测定，并以HepG2 细胞和α-葡萄糖苷酶作为体外受体模型，对其体外降血糖活性做了初步的研究，为后续研究其体内降血糖及作用机制提供一定的研究基础和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

南方红豆杉枝叶 购于无锡红豆集团南方红豆杉种植基地，药材经本院陈建伟教授鉴定为红豆杉科南方红豆杉Taxus chinensis var.mairei，饮片标本现保存于本校药学院中药化学实验室;葡萄糖对照品、95%乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、正丁醇、浓硫酸等其他试剂 国产分析纯;HepG2 细胞 南京中医药大学药学院;含酚红DMEM 高糖培养基 Gibco公司;胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司;四甲基偶氮唑盐(MTT) Sigma 公司;盐酸二甲双胍 上海衡山药业有限公司;葡萄糖测定试剂盒 南京建成生物工程研究所;胰岛素 江苏万邦生化医药股份有限公司;超纯水。

紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;超净工作台 苏州净化设备有限公司;酶标仪 美国BioTek 公司;倒置相差显微镜 日本OLYMPUS 公司;CO2培养箱 日本三洋(SANYO)公司;超纯纯水仪 南京易普易达科技发展有限公司;美国Corning-Coastar 细胞培养瓶、细胞培养板 上海艾研生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 南方红豆杉粗多糖的提取 称取干燥的红豆杉枝叶适量，打粉过10 目筛，混合均匀，第一次加8倍量的水，提取2h，第二次加6 倍量的水，提取1h，两次提取液合并，3000r/min 离心，保留上清液，减压浓缩，浓缩液加入95%乙醇至体积分数为80%，充分搅拌后静置24h，3000r/min 离心15min，弃去滤液。将所得沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚多次洗涤，30℃真空干燥，即得南方红豆杉粗多糖。

1.2.2 南方红豆杉多糖的含量测定

1.2.2.1 标准溶液的配制 精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品10.55mg，加适量水溶解，转移至100mL 容量瓶中，加水至刻度，摇匀，得到0.1055mg/mL葡萄糖标准溶液，备用。

1.2.2.2 苯酚溶液的制备 称取重蒸苯酚5.0g，加适量水溶解，转移至100mL 棕色容量瓶中，加水至刻度，摇匀，得到5%苯酚溶液，备用。

1.2.2.3 供试品溶液的制备 精密称取南方红豆杉多糖粉末16.68mg，加适量水溶解，室温下超声15min，转移至100mL 容量瓶中，定容，作为供试品溶液，备用。

1.2.2.4 标准曲线的绘制 精密吸取葡萄糖标准溶液0.1、0.2、0.4、0.5、0.7、0.8、0.9mL 置于10mL 具塞试管中，分别加水补齐至1.0mL，取超纯水1.0mL 作为空白对照，加入5%苯酚溶液1.0mL 充分混合后，迅速加入浓硫酸5.0mL，充分混合，室温放置5min 后置沸水中反应15min。取出并迅速插入冰水浴放置10min，于489nm 处测定吸收度。以葡萄糖标准溶液的浓度(μg/mL)为横坐标，吸光度A 为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.2.5 南方红豆杉药材中多糖的含量测定 精密吸取供试品溶液1.0mL 置于10mL 具塞试管中，取超纯水1.0mL 作为空白对照，按“1.2.2.4”下方法测定，计算南方红豆杉药材中多糖的含量。多糖含量(%)=(CDVW×103)/m ×100%，式中:C 为供试品溶液中葡萄糖的浓度(μg /mL)，D 为稀释倍数，V 为供试品溶液的体积(mL)，W 为药材中粗多糖的得率，m为供试品的质量(mg)。

1.2.3 南方红豆杉粗多糖的体外降血糖活性的测定

1.2.3.1 HepG2 细胞体外受体模型 HepG2 细胞的培养:HepG2 细胞复苏后采用含10% 胎牛血清的DMEM 高糖培养基置于37℃、5%CO2培养箱培养，待贴壁长满后，用0.25%胰蛋白酶消化，每3d 1∶3 传代一次，选取对数生长期细胞进行实验。

胰岛素抵抗HepG2 细胞模型的葡萄糖消耗实验及MTT 实验:按文献方法［9-10］稍作改进，将处于对数生长期的细胞消化后，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基调整细胞密度为5 ×104个/mL，接种于96 孔培养板中，每孔100μL 细胞悬液。本实验设正常对照组、模型组、二甲双胍组(终剂量为10-3mol/L)、南方红豆杉粗多糖组(终剂量分别为0.5、0.1、0.05、0.01、0.005mg/mL)。待细胞单层贴壁后，模型组更换新配制的含有胰岛素浓度为5 × 10-7mol/L 的DMEM 高糖培养基，于37℃、5% CO2培养箱中孵育24h，以造成胰岛素抵抗细胞模型。弃去培养基，给药组加入不同浓度的不含血清的含药培养基，正常对照组及模型组则加入不含血清的培养基，各组均包括含生理胰岛素组与不含生理胰岛素组。于37℃、5% CO2培养箱中孵育24h 后，用葡萄糖临床试剂盒检测培养基中的葡萄糖含量，计算各组细胞的葡萄糖消耗量。

葡萄糖消耗实验结束后，每孔加入5g/LMTT 溶液20μL，于37℃、5%CO2培养箱中继续培养，4h 后终止培养，小心吸弃孔中的培养基，每孔加入150μLDMSO，振荡器振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶标仪490nm 波长下测定各孔的吸光度值，以检测细胞的数目与活力。

1.2.3.2 α-葡萄糖苷酶体外受体模型 南方红豆杉粗多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用:参考文献［11 -12］的反应体系，96 孔板上加磷酸钾缓冲液(pH6.8)110μL，再加入0.2U/mLα- 葡萄糖 苷 酶20μL，10μL 样品溶液，混匀，37℃恒温15min 后，加入2.5mmol/L PNPG 20μL，混匀后37℃恒温反应15min。最后加入80μL 0.2mol/L 的Na2CO3溶液，于405nm 波长下测OD 值。

以阿卡波糖(Acarbose)为阳性对照，同时设定对照组(缓冲液+ 酶液+ 底物)，空白组对照组(缓冲液)，样品测定组(样品+酶液+底物)，样品对照组(样品+ 缓冲液)，阳性对照组(Acarbose + 酶液+底物。

酶活性抑制率= {1- (A样品- A样品对照)/(A对照-A空白)}×100

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

根据葡萄糖标准溶液的浓度和吸光度的线性关系，可以建立标准曲线，并求出回归方程。结果表明葡萄糖标准溶液在1.507～13.563μg/mL 内呈良好线性关系(见图1)。南方红豆杉药材中多糖的含量测定结果为1.75%。

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度实验 精密吸取供试品溶液1.0mL 置于10mL 具塞试管中，取超纯水1.0mL 作为空白对照，按“1.2.2.4”下方法测定，连续6 次测定的实验结果显示，RSD 为1.71%，表明该方法具有良好的精确度(见表1)。

表1 精密度实验Table 1 Precision of the measured results

表2 稳定性实验Table 2 Stability of the measured results

表3 重现性实验Table 3 Reproducibility of the measured results

表4 加样回收率实验Table 4 Recovery rate of the measured results

图1 葡萄糖溶液的标准曲线图Fig.1 Standard curve of glucose standard solution

2.2.2 稳定性实验 精密吸取供试品溶液1.0mL 置于10mL 具塞试管中，取超纯水1.0mL 作为空白对照，按“1.2.2.4”下方法测定，在反应结束后0、5、10、15、30、60、90、120min 测定的实验结果显示，供试品溶液在2h 之内保持稳定(见表2)。

2.2.3 重复性实验 称取同一批次干燥的南方红豆杉枝叶5 份，按“1.2.2.3”和“1.2.2.4”下方法进行操作，考察实验方法的重现性。结果显示，RSD 为1.35%，表明该方法重现性较好(见表3)。

2.2.4 加样回收率实验 精密吸取供试品溶液0.4mL 置于10mL 具塞试管中，共9 份，依次加入葡萄糖标准溶液0.2、0.4、0.6mL，并添加水使终体积为1.0mL，取超纯水1.0mL 作为空白对照，按“1.2.2.4”下方法测定，考察加样回收率。结果显示，平均加样回收率为97.54%，RSD 为1.60%(表4)，表明该方法具有良好的准确度。

2.3 南方红豆杉粗多糖的体外降血糖活性

2.3.1 南方红豆杉粗多糖对胰岛素抵抗HepG2 细胞葡萄糖消耗的影响 南方红豆杉粗多糖对胰岛素抵抗HepG2 细胞葡萄糖消耗的影响见表5。

从表5 数据得出，南方红豆杉粗多糖对胰岛素抵抗HepG2 细胞的葡萄糖消耗具有促进作用，当给药浓度为0.05mg/mL 时，效果最佳。同时，MTT 结果显示，所设的给药剂量对HepG2 细胞均具有不同程度的抑制作用，即表示南方红豆杉粗多糖能促进胰岛素抵抗HepG2 细胞的葡萄糖消耗并非由于其促进细胞增殖引起的，在扣除MTT 影响时，南方红豆杉粗多糖仍表现出较好的促进糖消耗作用。

同时表中数据还显示，建立胰岛素抵抗模型后细胞有增殖，MTT 值大于正常空白组。而生理胰岛素的加入则会促进细胞的轻度增殖，扣除MTT 影响后发现，南方红豆杉粗多糖与生理胰岛素具有一定的协同作用。

2.3.2 南方红豆杉粗多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制活性的影响 南方红豆杉粗多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制活性的影响见表6。

表6 中的数据显示，南方红豆杉粗多糖抑制活性较好，抑制率明显高于阳性对照药物，且对α-葡萄糖苷酶的抑制作用具有剂量依赖性，对南方红豆杉粗多糖开发成α-葡萄糖苷酶抑制剂具有实际的指导意义。

表5 南方红豆杉粗多糖对胰岛素抵抗HepG2 细胞葡萄糖消耗的影响Table 5 Effect of crude polysaccharides from Taxus chinensis var.mairei to the glucose consumption of insulin-resistance HepG2 cells

表6 南方红豆杉粗多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制活性的影响Table 6 Effect of crude polysaccharides from Taxus chinensis var.mairei to inhibitory activity of alpha-glucosidase

3 讨论

3.1 南方红豆杉粗多糖对α-葡萄糖苷酶具有抑制作用

α-葡萄糖苷酶抑制剂可以防治餐后高血糖症和缓解高胰岛素血症，同时可以提高糖耐量，具有十分广阔的应用前景。苦瓜有“药用蔬菜”之称，现代研究表明苦瓜中皂苷［13-14］、多糖［15-16］可能是其发挥降糖作用的主要活性成分，苦瓜皂苷和多糖对α-葡萄糖苷酶具有抑制活性，其IC50值分别为1.03mg/mL 和10.73mg/mL［17］。茶多糖也显示较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其α-葡萄糖苷酶IC50值为3.2 g/L［18］。与上述两种植物比起来，南方红豆杉粗多糖的IC50值为38.61mg/L 远优于它们，说明南方红豆杉粗多糖对α-葡萄糖苷酶抑制活性较高。

3.2 南方红豆杉粗多糖对胰岛素抵抗HepG2 细胞的葡萄糖消耗量具有促进作用

在HepG2 细胞体外模型中，无论是否加入生理胰岛素，南方红豆杉粗多糖对胰岛素抵抗HepG2 细胞的葡萄糖消耗量均具有促进作用，加入生理胰岛素后更具有协同加强作用。

4 结论

从两种不同的体外降血糖模型实验结果可以初步判断南方红豆杉粗多糖具有体外降血糖活性，但还存在一些不足，如胰岛素抵抗模型的分子机制、降糖的机理还有待进一步研究。此外，南方红豆杉粗多糖中成分比较复杂，含有多糖的同时还含有蛋白质、氨基酸等等，对于除去蛋白质后的精多糖降糖活性如何还有待下一步继续研究，为后续的体内降血糖实验和进一步开发打下基础。

［1］湖北省革命委员会卫生局.湖北中草药志［M］.湖北:湖北人民出版社，1978:473.

［2］谢志慧，杜玲玲，李效贤，等.南方红豆杉研究新进展［J］.中国药业，2009，18(15):3-5.

［3］孔繁晟.云南红豆杉枝叶中抗癌活性成分的提取工艺与黄酮类化合物的研究［D］.广州:南方医科大学，2007.

［4］李存芳，刘勇，董玫，等.南方红豆杉化学成分的研究进展［J］.中草药，2007，38(8):1121-1132.

［5］严金龙，吕志敏.植物多糖的提取分离和应用市场［J］.化工科技市场，2004，27(11):41-44.

［6］张锦雀，黄丽英，苏聪枚.中草药多糖提取分离纯化研究进展［J］.中药材，2008，31(11):1760-1765.

［7］王玉华，袁久荣.中药多糖的化学研究现状［J］.中成药，2009，26(6):496-498.

［8］Duo Zhang，Heng Meng，Hai-shan Yang.Antidiabetic activity of Taxus cuspidata polysaccharides in streptozotocin- induced diabetic mice ［J］ . International Journal of Biological Macromolecules，2011，50(2012):720-724.

［9］姜斐，姚楠，钱士辉，等.女贞子化学成分的提取分离鉴定与活性研究［D］.南京:南京中医药大学，2010.

［10］朱银荣，肖雯，张继.沙蒿多糖及其衍生物的体外降血糖活性研究［D］.兰州:甘肃农业大学，2011.

［11］康文艺，张丽，宋艳丽.滇丁香中抑制α-葡萄糖苷酶活性成分研究［J］.中国中药杂志，2009，34(4):406-409.

［12］陈百泉，李昌勤，常星，等.头花蓼对α-葡萄糖苷酶的抑制活性研究［J］.中国实验方剂学杂志，2010，16(8):151-153.

［13］Nivitabishekam SN，Asad M，Prasad VS.Pharmacodynamic interaction of Momordica charantia with rosiglitazone in rats［J］.Chemico-Biological Interactions，2009，177(3):247-253.

［14］王先远，金宏，徐志勤，等.苦瓜皂甙降血糖作用及其机制初探［J］.氨基酸和生物资源，2001，23(3):42-45.

［15］徐斌，董英，张慧慧，等.苦瓜多糖对链脲佐菌素诱导糖尿病小鼠的降血糖效果［J］.营养学报，2006，28(5):401-408.

［16］Parichat B，Artiwan S.Extraction of phenolic compounds from fruits of Bitter Melon(Momordica charantia)with subcritical water extraction and antioxidant activities of these extracts［J］.Chiang Mai Journal Science，2008，35(1):123-130.

［17］王琪，邓媛元，张名位，等.苦瓜皂苷和多糖的连续提取工艺及其对α-葡萄糖苷酶的抑制作用［J］.中国农业科学，2011，44(19):4058-4065.

［18］全吉淑，尹学哲，及川和志.茶多糖降糖作用机制［J］.中国公共卫生，2007，23(3):295-296.