张 岱，孙培培，黄明泉 ，孙宝国，邹青青

(北京工商大学，北京市食品风味化学重点实验室，食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京100048)

氯丙醇是甘油(丙三醇)结构上的羟基被氯原子取代的一类化合物，包括3 - 氯- 1，2 - 丙二醇(3-MCPD)、2-氯-1，3-丙二醇(2-MCPD)、1，3-二氯-2-丙醇(1，3-DCP)和2，3-二氯-1-丙醇(2，3-DCP)［1］。其中，3-氯-1，2-丙二醇是氯丙醇类化合物中常见的代表物质，具有很强的毒性。目前的研究已初步证明3-MCPD 可以使染色体发生畸变［2-3］。同时，Haratake J 等研究发现，3-MCPD 能减少精子数、降低精子活性，使雄性动物生殖能力减弱［4］。另外，小鼠口服3-MCPD 会引发部分器官产生良性肿瘤［5］。氯丙醇也是目前公认的食品污染物之一，它主要存在于盐酸水解植物蛋白(HVP)加工而成的酱油等调味汁中。此外，氯丙醇污染还扩大到其它食品中，包括饼干、面包和肉制品［6-8］。张明霞［9-10］等在对膨化食品检测中发现，所测膨化食品中均含有氯丙醇类化合物。食品中氯丙醇的来源主要有两种途径:一是外源性污染，如包装材料的污染、食品原料的引入;二是食品在制造过程中生成，如酱油、蚝油等调味品在加工过程中，油脂的水解产物会与氯化物反应生成氯丙醇［11］，主要是含HVP 的配制酱油中氯丙醇污染最为严重［12-15］。为了控制食品中氯丙醇的含量水平，减少其对身体健康的危害，人们对食品中氯丙醇的形成机理和影响因素进行了研究。Pavel等［16］以NaCl、甘油、大豆卵磷脂和三油酸甘油酯三者组成的混合物建立模型热反应，发现3-MCPD 的形成主要依赖于NaCl 的浓度。Colin 等［17］考察了面粉、盐、水三者混合后发酵产物中氯丙醇的形成因素，发现3-MCPD 的形成受温度、湿度等外界条件的影响。HAMLET 等［18］向面团中加入葡萄糖，模拟烘焙食品中氯丙醇的形成动力学模型，发现葡萄糖能使3-MCPD的含量增加。目前对热反应香精中氯丙醇的形成机理和影响因素尚未见报道。为了研究热反应香精制备过程中油脂与氯化钠反应生成氯丙醇的过程和影响因素，本研究以甘油、氯化钠和水建立了热反应模型，利用正交实验，考察了各个因素(时间、温度、NaCl 和甘油用量)对3-MCPD 生成量的影响，同时也考察了单糖和氨基酸对3-MCPD 生成的影响，旨在探讨3-MCPD 生成机理及其影响因素，控制食品中氯丙醇的含量水平，减少其对身体健康的危害。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

正己烷、无水乙醚、无水硫酸钠 均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司;硅藻土 化学纯，北京化学试剂公司;七氟丁酰基咪唑 衍生化试剂，上海梯希爱化成工业发展有限公司。

1mL 气密针 Agilent 公司;KH-500DE 型数控超声波清洗器 昆山超声仪器有限公司;EYELA N-1001型旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司;N-EVAP型干浴氮吹仪 上海思伯明仪器设备有限公司;TRACE ULTRA-DSQⅡ型气相色谱—质谱联用仪 美国Thermo Fisher 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 3- MCPD 形成条件正交实验设计影响3-MCPD反应的关键因素通常包括反应时间、反应温度和反应物的用量，因此本实验对于时间、温度、甘油和氯化钠用量组成的模型体系的反应［19-21］，通过正交实验考察上述4 个因素对3-MCPD 形成的影响。

Breitling-Utzmann［19］等曾向面团中按照相应比例添加不同成分，如:油脂、盐、乳化剂、糖等，然后在各个温度下进行烘焙，考察3-MCPD 的生成情况;Hamlet［20］等研究了面团模型体系中甘油、氯化物分别在0～2.4%、0～2.5%浓度范围内对3-MCPD 形成的影响;SVEJKOVSKá［21］等模拟食品实际加工过程，测定各种因素(豆油量、氯化钠含量、水分含量和温度)对3-MCPD 产量的影响。综合以上研究结果，同时排除误差干扰、避免甘油和NaCl 用量过低或过高等极端化条件，优化实验条件使其具有实际意义。本实验确定了正交实验中考察的4 个因素的水平(表1)，其中，甘油用量占物料总量≤1.0%、NaCl 用量占物料总量＜13.0%，水的用量固定值为15.0mL。

表1 不同条件下生成3-氯-1，2-丙二醇的正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal array design for thermal reaction of 3-MCPD formation

1.2.2 不同种类单糖和氨基酸对3-MCPD 生成量的影响 为了更好地模拟食品加工过程中的实际热反应，在正交实验基础上研究了常见单糖和氨基酸对3-MCPD形成的影响，选择3-MCPD 生成量最多的热反应条件进行实验。根据实际热反应中单糖和氨基酸的用量，向模型热反应中分别加入占总质量3.0%的5 种单糖:葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、甘露糖;以及占总质量2.0%的17 种常见氨基酸:天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、脯氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸、缬氨酸、色氨酸、甘氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、酪氨酸。同时，做空白对照实验，并计算收率。

3-MCPD 收率(%)=(加入单糖或氨基酸后生成量-空白实验生成量)/空白实验生成量×100

1.2.3 GC-MS 分析条件 色谱条件:Rtx-5 毛细管柱(30m ×0.25mm，0.25μm);进样口温度260℃;升温程序:起始温度50℃，保持1min，以2℃/min 程序升温到90℃，再以40℃/min 升至280℃，保持5min;载气(He)流速1.0mL/min，进样量1.0μL;不分流进样。

质谱条件:电子轰击(electron impact ion source，EI)离子源;电子能量70eV;传输线温度250℃;离子源温度 200℃;溶剂延迟12min;选择离子扫描(SIM)，m/z 253、275、289、291 和453 作为3-MCPD定性鉴别离子，m/z 253 作为3-MCPD 定量分析离子。

1.2.4 3-MCPD 含量的测定 采用气相色谱/质谱法(GC/MS)测定3-MCPD 含量，参见国家标准《GB/T 5009.191-2006 食品中氯丙醇含量的测定》［22］。

2 结果与分析

2.1 甘油与氯化钠模型热反应各因素对3-MCPD生成量的影响

在甘油与氯化钠模型热反应中，通过正交实验考察了反应时间、温度和各原料用量的影响，正交实验结果见表2。

根据表2 中的K 值确定在A3B2C4D2条件下，生成3-MCPD最少;在A4B3C2D4条件下，3-MCPD 生成量最多，与表2 中实验15 相对应，为0.852mg/kg。同时，在表2 中，在实验8 条件下3-MCPD 的生成量最少，仅为0.005mg/kg，二者相差达170 倍之多。对正交表中实际测得3-MCPD 最小生成量条件(实验8)与由K 值得出的最优条件A3B2C4D2进行验证。结果表明，实验8 目的产物的生成量相比于A3B2C4D2较少。因此，实验8(A2B4C3D2)为最适条件，即反应时间2h、反应温度140℃、甘油用量0.05g(占原料总量0.31%)、NaCl 用量1.0g(6.23%)、水用量15g(93.46%)条件下，3-MCPD 生成量最少，确定为最优条件。

表2 不同条件下3-氯-1，2-丙二醇生成量的正交实验结果Table 2 The result of the orthogonal experiment of formation of 3-MCPD

各因素对3-MCPD 生成量影响的主次顺序为时间＞甘油用量＞NaCl 用量＞反应温度。其中，热反应时间对生成量的影响作用最大，反应温度作用最小。

2.2 不同种类单糖对3-MCPD 生成量的影响

单糖一般是多羟基醛或多羟基酮。其中，葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖均为醛糖，果糖是酮糖。为了考察糖类物质对3-MCPD 生成量的影响，向热反应最优条件模型中，加入5 种单糖，并与空白实验进行对照，结果见图1。

如图1 所示，加入5 种单糖后3-MCPD 的生成量均减少。其中，葡萄糖对3-MCPD 生成量的影响最小，果糖、木糖、甘露糖影响作用依次增强，半乳糖影响最为明显。其原因可能是在高温条件下糖的醛基或酮基可以与3-MCPD 发生缩合反应，从而减少3-MCPD的生成量(如图2、图3)［23］。此外，单糖自身可发生裂解，生成含有3 个碳原子的醛或酮，如甘油醛，再与3-MCPD 发生缩合反应而降低3-MCPD 的含量。

2.3 不同种类氨基酸对3-MCPD 生成量的影响

图1 不同糖类物质对3-MCPD 收率的影响Fig.1 Yield of 3-MCPD influenced by different carbohydrates

图2 3-MCPD 与醛糖反应方程式Fig.2 3-MCPD and aldose reaction equation

图3 3-MCPD 与酮糖反应方程式Fig.3 3-MCPD and ketose reaction equation

在最优条件下，加入17 种不同种类氨基酸，与空白实验进行对照，考察了氨基酸对3-MCPD 生成的影响，结果见图4。

图4 常见氨基酸对3-MCPD 收率的影响Fig.4 Influence of common amino acids on the yield of 3-MCPD

如图4 所示，谷氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸使3-MCPD 的生成量增加;缬氨酸、精氨酸、赖氨酸、丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、组氨酸减少3-MCPD 的生成量;半胱氨酸、酪氨酸、脯氨酸、色氨酸对3-MCPD 的生成无明显作用。

在热反应模型中加入氨基酸后，会与生成的3-MCPD发生化学反应，其中以酯化反应最为常见。由于氨基酸种类多样，物理化学性质不同，因此不同氨基酸与3-MCPD 发生的反应存在差异。

在甘油通过一氯取代生成3-MCPD 的亲核取代反应中，酸性条件可促进反应，但介质酸性类型和酸度高低对反应的影响程度不同［24-25］。天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸的等电点pI ＜7，在中性溶液中水解显酸性，故利于3-MCPD 的生成，因此3-MCPD的生成量增加。其中，谷氨酸酸性较强，蛋氨酸溶解度较大，故二者对3-MCPD 的生成量影响较为明显。赖氨酸、精氨酸、组氨酸属于碱性氨基酸，等电点pI ＞7，在中性溶液中水解显碱性，羟基会取代氯离子生成甘油，故不利于3-MCPD 的生成。

缬氨酸、亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸以与3-MCPD 发生酯化反应为主(见图5)［26］，从而使3-MCPD的生成量减少。

图5 3-MCPD 与氨基酸发生酯化反应方程式Fig.5 Esterification reaction equation of 3-MCPD and amino acid

3 结论

3.1 通过正交实验，经过GC-MS 分析得出了最优条件，即在反应时间2h，温度140℃，甘油用量0.05g(占原料总量0.31%)、NaCl 用量1.0g(6.23%)、水用量15g(93.46%)条件下3-MCPD 生成量最少。其中，影响3-MCPD 生成量的首要因素是时间，甘油用量是较重要因素，NaCl 用量是次要因素，反应温度对3-MCPD 生成量的影响作用最小。在实际热反应中可以对各个影响因素进行相应的调整和控制，以减少食品加工过程中3-MCPD 的形成。

3.2 由于不同物质在物理化学性质上存在差异，与3-MCPD 发生的反应不同，因此对3-MCPD 生成量的影响不同。结果表明:葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖、半乳糖、缬氨酸、精氨酸、赖氨酸、丝氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、组氨酸使3-MCPD 的生成量减少;谷氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸使3-MCPD的生成量增加;半胱氨酸、酪氨酸、脯氨酸、色氨酸对3-MCPD 的生成无明显作用。

3.3 本实验就各个因素对3-MCPD 形成的影响作用进行了初步探讨，但是对于实际热反应中3-MCPD的形成机理和具体产物还需深入研究。

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