赵 娜，萨如拉，郭 军，乌云达来

(内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特010018)

乳酸菌既能赋予产品优良的感官性质，增加发酵食品的安全性，又能部分抑制原材料中腐败微生物和致病菌的生长［1］，产生具有抑菌或杀菌效果的有机酸、过氧化氢、双乙酰和细菌素等［2］。细菌素是细菌产生的一种抗菌物质，它是在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有抗菌活性的多肽或前体多肽，抗菌对象主要是产生菌分类上相近的细菌［3-4］。近几十年，已经从乳杆菌中分离出十几种细菌素，而且不断有新的乳杆菌素被分离出来［5］，如植物乳杆菌细菌素BacTN635［6］、嗜酸乳杆菌细菌素TS1［7］等。随着研究的深入，人们把陆续发现的一些不符合或不完全符合细菌素定义的拮抗物质称为类细菌素［8-9］。类细菌素对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌等都具有抑制作用［10］，其抗菌谱比细菌素更广，这一特性决定了它具有比细菌素更广泛的应用前景［11］。本文从分离自内蒙古地区传统乳制品的乳酸菌中筛选出一株广谱抗菌活性瑞士乳杆菌AJT，对其抗菌物质特性进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

瑞士乳杆菌AJT 分离自内蒙古地区传统乳制品;指示菌 为实验室保藏菌株(见表3);脱脂乳培养基、MRS 液体培养基、营养琼脂培养基、PDA 培养基 根据文献［12］方法配制;0.45、0.22μm 微孔滤膜 购自天津东康科技有限公司;胃蛋白酶 购自SIGMA-ALDRICH 公司;胰蛋白酶 购自AMRESCO公司;木瓜蛋白酶(德国进口分装) 购自国药集团化学试剂有限公司;蛋白酶K 购自上海江莱生物科技有限公司;过氧化氢酶 购自西安国安生物科技有限公司。

超净工作台ZHJH-C1214C 南京依贝仪器设备有限公司;立式压力灭菌器YXQ-LS-30 SII 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;pH 计PB-10 Sartorius 集团;电热恒温培养箱DHP-9082 上海一恒科技有限公司;恒温水浴锅JC-HH-S26济南精诚实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵液的制备 将真空干燥保存的菌株AJT于脱脂乳培养基中活化1～2 代，接种于MRS 液体培养基，活化3 代。按2%体积比接种于50mL MRS 液体培养基，培养24h，8000r/min 离心10min，取上清液0.45μm 滤菌器过滤除菌，冷藏备用。

1.2.2 指示菌的培养 将大肠杆菌等细菌用营养琼脂斜面培养基37℃培养;真菌用PDA 斜面培养基28℃培养，4℃保存备用。

1.2.3 菌株AJT 抗菌活性测定 将菌株AJT 按体积比例2%接种于MRS 液体培养基中，每隔2h 测其OD600nm及pH，将菌液8000r/min 离心10min，0.22μm滤菌器滤菌后以大肠杆菌ACCC 10145 做指示菌，通过牛津杯法测定其抗菌活性，实验进行三个平行。

1.2.4 抗菌物质的提取 根据抗菌物质产生情况，取抗菌物质活性最佳时的发酵上清液200mL，60℃浓缩至50mL 左右，用乙酸乙酯萃取摇瓶过夜，静置6h 后取上层低温干燥，沉淀用甲醇抽提［13］2 次，8000r/min 离心10min，上清液经真空低温干燥，得到的沉淀用灭菌蒸馏水溶解后即为抗菌物质提取液，将其4℃保存备用。

1.2.5 酸抑制作用的排除 乳酸菌在代谢过程中能产生多种具有抑菌活性的产物，包括酸性物质、CO2、H2O2、细菌素及类细菌素等［14］。为排除酸性末端产物的干扰，用2mol/L NaOH 将抗菌物质提取液pH 调节为5.0，以乳酸和乙酸调节pH 至5.0 的灭菌蒸馏水作对照，进行牛津杯法抑菌实验。

1.2.6 过氧化氢干扰的排除 乳酸菌代谢产生的过氧化氢也可抑制细菌的生长，尤其是抑制革兰氏阴性菌的生长［15］。取1mL 抗菌物质提取液，加入过氧化氢酶，使其终浓度达1mg/mL，以未经过氧化氢酶处理的抗菌物质提取液作为对照，37℃水育24h，以大肠杆菌做指示菌，测定抗菌活性。

1.2.7 抗菌物质的热稳定性 将抗菌物质提取液分别在-37、-20、37、60、90、100、121℃条件下处理30min，以4℃保存的提取液作对照，进行牛津杯抑菌实验，比较抑菌活性强弱。

1.2.8 抗菌物质的pH 稳定性 取等量的菌株AJT的抗菌物质提取液，用1mol/L HCl 和2mol/L NaOH分别调节pH 至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，以未处理的提取液作为对照，测定抑菌活性。

1.2.9 抗菌物质的蛋白酶敏感性 取4 份抗菌物质提取液，用1mol/L HCl 和2mol/L NaOH 分别调节至胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K 和木瓜蛋白酶的最适pH(依次为7.4、2.0、7.4 和6.0)，按终浓度1.0mg/mL加入各酶液，37℃反应2h 后，沸水处理5min。将pH调回到原始值，以未处理的提取液作对照，进行抑菌实验。

1.2.10 抗菌物质的紫外线敏感性 取4 份等量抗菌物质提取液，0.22μm 滤菌器滤菌，取三份提取液平铺于灭菌平皿，于40W 紫外灯下分别辐照10、30、120min，另外一份作为对照，测定抑菌活性。

1.2.11 抗菌物质的抑菌谱 用不同的革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌做指示菌，进行牛津杯扩散抑菌实验，每支牛津杯加入200μL 抗菌物质提取液［16］。

1.2.12 数据处理 用软件DPS v6.55 进行数据分析。

2 结果与讨论

2.1 菌株AJT 抗菌活性测定

将瑞士乳杆菌AJT 按2% 体积比接种于起始pH6.5 的MRS 液体培养基，置37℃培养60h 的生长曲线及抑菌活性曲线见图1。由图1 可知，菌株AJT培养至2h 即进入对数生长期，12h 左右进入稳定期;pH 于培养4h 显著下降，16h 后趋于稳定，从整个发酵过程可以看出菌株AJT 产酸能力较强，最终pH 稳定在3.8 左右。从对数期前期(6h)开始，菌株AJT 具有抗菌活性，这与瑞士乳杆菌G51 类似［17］。进入稳定期(12h)后抗菌物质产量持续增加，稳定期中期(20h)抗菌物质活性达到最高水平，之后抑菌活性稍微有所下降，故后期抗菌物质研究中以发酵20h 的发酵液为研究对象，这一特性与短乳杆菌FPTLB3 所产抗菌物质特性类似，菌株FPTLB3 抑菌活性在19h时达到最大值［18］。

图1 菌株AJT 生长曲线及抑菌活性测定Fig.1 Production profile of the active antimicrobial substance produced by Lactobacillus helveticus AJT

2.2 酸抑制作用的排除

乳酸菌在代谢过程中可能会产生酸性抑菌物质，如乳酸、乙酸和其他有机酸类，为排除酸性末端产物干扰，将菌株AJT 的抗菌物质提取液pH 调节至5.0，与乳酸和乙酸调节pH 至5.0 的灭菌蒸馏水对比，以大肠杆菌做指示菌，进行抑菌实验。结果如表1 所示，pH5.0 的抗菌物质提取液抑菌活性依然很强，而pH5.0 的乳酸、乙酸不显示抑菌活性。故菌株AJT 的抗菌物质提取液排除酸性末端产物的干扰后，仍存在其他的抑菌活性物质。

2.3 过氧化氢作用的排除

乳酸菌在代谢过程中可能产生过氧化氢，也能抑制其他细菌的生长，故应排除过氧化氢的干扰。设置对照组的排除过氧化氢实验结果见图2，用过氧化氢酶处理的抗菌物质提取液与对照组的抑菌圈直径大小接近，故排除抗菌活性由过氧化氢所致。

表1 酸抑制作用的排除Table 1 Eliminate the effect of organic acids

图2 过氧化氢作用的排除Fig.2 Eliminate the effect of hydrogen peroxide

2.4 抗菌物质的热稳定性

将等量抗菌物质提取液在不同的温度下处理30min，以4℃保存的提取液做对照，抑菌实验结果见图3，经不同温度处理后的样品抑菌圈直径大小无显著差异，说明菌株AJT 所产抗菌物质具有热稳定性。

图3 不同温度对抗菌物质的影响Fig.3 Effect of temperature on the inhibitory activity of antibacterial substance

2.5 抗菌物质的pH 稳定性

分别调节至不同pH 的抗菌物质水溶液和未经处理的抗菌物质水溶液的抑菌实验，结果如图4 所示，抗菌物质的有效抑菌pH 范围为2.0～5.0，在pH2.0 时，抑菌圈直径最大，随着pH 增大，抑菌圈直径逐渐下降，至pH6.0 时完全失去抑菌活性。由于原始提取液的pH 为3.04，所以对照的抑菌圈直径与调节pH 至3.0的样品的抑菌圈直径大小相当。

2.6 抗菌物质的蛋白酶稳定性

图4 pH 对抗菌物质活性的影响Fig.4 Effect of pH on the inhibitory activity of antibacterial substance

将抗菌物质水溶液经不同蛋白酶处理后灭酶，然后进行牛津杯扩散抑菌实验，结果如图5 所示。与对照比较，经蛋白酶处理后的抗菌物质的抑菌活力均显著下降，但仍然具有很强的抑菌活性，表明该提取液中抗菌物质为蛋白类或非单一抗菌物质组成，具体成分有待进一步分析确定。

图5 抗菌物质的蛋白酶敏感性Fig.5 Inhibitory activities of antimicrobial substance after being treated by protease

2.7 抗菌物质的紫外线敏感性

在40W 紫外灯下辐照10、30、120min 的抗菌物质水溶液及未处理样品的抑菌活性见表2，经紫外线辐照不同时间的抗菌物质提取液抗菌活性与对照的抗菌活性无显著差异，说明菌株AJT 所产抗菌物质对紫外线不敏感。

表2 抗菌物质的紫外线敏感性Table 2 Inhibitory activities of antimicrobial substance after being treated by UV

2.8 抗菌物质的抑菌谱

通过以不同的革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌做指示菌，进行牛津杯扩散抑菌实验，得到菌株AJT 所产抗菌物质的抑菌谱，见表3:

由表3 可以得出，菌株AJT 产生的抗菌物质对所选的指示菌均显示了抗菌活性，其中对大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、少孢根霉显示了很强的抗菌活性，抑菌圈直径30mm 以上;对金黄色葡萄球菌、荧光假单胞杆菌、扩展青霉、烟曲霉、黄色镰刀菌显示了较强的抗菌活性，抑菌圈直径20mm 以上;但其对米曲霉的抗菌活性较弱。瑞士乳杆菌AJT 产生的抗菌物质的抑菌谱，与已报道的类细菌素的抗菌谱类似，如嗜酸乳杆菌产生的类细菌素Lactobacillin NX2-6，也对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌具有较强的抑制作用［19］;乳酸菌SD-22 产生的类细菌素Lactobacillus SD-22，对革兰氏细菌及部分真菌有明显的抑制作用［15］。由于细菌素的定义存在多种说法，对类细菌素的归属也缺乏一个统一的标准［20］。根据目前已报道的细菌素和类细菌素的特性区别，基于瑞士乳杆菌AJT 所产抗菌物质的抗菌谱及热稳定等特性，初步将菌株AJT 产生的抗菌物质归为类细菌素。

表3 菌株AJT 抗菌物质的抑菌谱Table 3 Antimicrobial spectrum of Lactobacillus helveticus AJT

3 结论

从内蒙古地区传统乳制品中分离到的广谱抗菌活性瑞士乳杆菌AJT，其产生的抗菌物质排除酸和过氧化氢的抗菌作用后，对热稳定，在pH2.0～5.0 有较强活性，对胃蛋白酶等蛋白酶敏感，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌均具有抗菌活性。尤其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等常见致病细菌和少孢根霉、扩展青霉等真菌具有明显的抑制作用，因此，其在食品保藏及农业、畜牧业等方面具有潜在应用能力。

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