任文瑾，吕 娇，苏昕峰，刘 雄

(重庆西南大学食品科学学院，重庆北碚400715)

辣椒素(capsaicin)分子式为C18H27NO3，其化学名称为反-8-甲基-N-香草基-6-壬烯基酰胺，是辣椒风味中的主要成分。辣椒味辛、性热，入心、脾二经，有温中散寒、开胃消食的功效，对治疗寒滞腹痛、呕吐、泻痢等有着一定功效并且对胃痛、胃胀及消化不良等有很好的调理作用［1-2］。辣椒素药理作用广泛，在镇痛方面有重要作用［3-5］，同时具有防治心血管疾病［6］、呼吸道疾病［7］的作用，还能用于减肥［8］、治疗风湿性关节炎［9］、银屑病［10］等。辣椒素是一种酰基化的香草酸同源同系物，其受体为香草酸受体亚型(vanilloid receptor1，VR1)。VR1 在神经细胞表达水平最高［11］，在膀胱、子宫、鼻粘膜、呼吸道和结肠等部位都检测出辣椒素受体。VR1 可参与胃肠道消化液分泌，促进胃肠蠕动［12］，对肠道健康有重要作用。但也有研究表明辣椒素对人体肠道有不良影响。Hammer 等［13］报道给健康人灌胃辣椒素会即刻产生腹部痉挛和疼痛现象。Johnson［14］研究发现对断奶大鼠喂食8 周5%的辣椒素会引起胃肠管道角质化和侵蚀斑。有报道称［15］，饲喂辣椒素的大鼠大肠末端和末端小肠、肝脏及大肠内容物中会产生类似饲喂1，2-二甲基肼的现象，释放有毒物质。大量研究表明，肠道健康与短链脂肪酸产量、肠道pH、氨和苯酚浓度、次级胆汁酸分泌和粪水中细胞毒素含量、排空时间及肠道菌活性等方面相关［16］。体外实验表明辣椒素有较强的抑菌效果，那么它能否抑制人体肠道菌群，影响其正常分布，进而影响肠道发酵环境是值得研究的一个问题。体外发酵作为动物实验的补充有很多优点:可以跟踪发酵过程中物质的变化及研究发酵产物的形成过程，弥补了体内发酵不能实现动力学检测的缺点;还可实现标准化操作，重复性强。实验拟采用体外发酵实验观察辣椒素对肠道发酵环境的影响，以期为辣椒的科学消费提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

雄性SD 大鼠 重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司;天然辣椒素 河南倍特生物科技有限公司，辣椒总碱含量95.7%;氯化钠、苯酚、次氯酸钠、冰乙酸、亚硝基铁氰化钠、吐温80、氯化铵、氢氧化钠 成都市科龙化工试剂厂，分析纯;硫酸 成都市科龙化工试剂厂，ρ =1.84g/mL，优级纯;乙酸 A Johnson Matthey Company，色谱级;巴豆酸、丙酸、丁酸、异丁酸 梯希爱上海化成工业发展有限公司，色谱纯;伊红-美兰琼脂培养基(EMB) 北京奥博星生物技术有限公司，生物试剂;双歧杆菌选择性培养基(BS)、乳酸菌选择性培养基(LBS) 青岛海博生物技术有限公司，生物试剂;高纯二氧化碳气体 重庆朝阳气体有限公司，99.999%。

Sepctrumlab 22 可见分光光度计 上海棱光技术有限公司;WH-1 微型旋涡混合仪 上海沪西分析仪器厂;JA2003A 电子天平 上海精天电子仪器有限公司;DHG-9070 电热恒温鼓风干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司;PHS-3C 精密酸度计 上海大普仪器有限公司;5810 型台式离心机 德国Eppendorf公司;SIGMA 低温离心机 德国SIGMA 公司;ARI14紫外分光光度计 上海爱朗仪器有限公司;GC-2010气相色谱 日本岛津公司;KQ-100 超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;SW-CJ-1FD 洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;HH-B11 电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂;BC-J160S 二氧化碳细胞培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;ES - 315 高压蒸汽灭菌锅KAGOSHIMA SEISAKUSYO INC;ZHWY - 100C 恒温培养振荡器 上海智诚分析仪器制造有限公司;Stabilwax-DA毛细色谱柱 美国RESTEK 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵液制备

1.2.1.1 发酵液配比 查阅相关文献及前期的实验表明，辣椒素引起的大鼠血脂变化及肠道损伤与灌喂剂量相关。体外发酵液配比见表1。

表1 发酵液配比Table 1 Compounds of each fermentation liquid

1.2.1.2 体外发酵步骤 a.于无菌条件下取出6 只雄性大鼠的盲肠内容物，称量8g 内容物装入预先灭菌的50mL 带盖离心管中，称重，鼓入高纯CO2气体5min，盖上盖子待用。

b.用9 倍(V:m)无菌生理盐水稀释盲肠内容物，涡旋震荡5min 混匀，4 层纱布过滤。

c.取12 支100mL 高温灭菌后的高温瓶，每支高温瓶中加入5mL 盲肠内容物滤液和45mL 灭菌基础培养液(牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g，定容至1000mL，pH7.0 ～7.2)，将高温瓶分为4 组(每组3支)，分别加入0、2.5、5.0、7.5mg 辣椒素，配制成辣椒素浓度分别为0、0.05%、0.1%、0.15%的发酵液(见表1)，鼓入高纯CO2气体20min，盖好橡胶塞后蜡封。在60～80r/min 转速的恒温培养振荡器上37℃摇床培养10h，终止发酵，检测发酵液的pH、游离氨、SCFA 及微生物。

1.2.2 生化指标检测

1.2.2.1 pH 测定 取发酵液样品5mL 于4000r/min下离心5min，吸取上清液2mL，用精密酸度计测上清液pH。

1.2.2.2 发酵液游离氨测定 无氨水制备［17］:在1000mL 蒸馏水中，加入0.10mL 硫酸(ρ =1.84g/mL)，并在全玻璃蒸馏器中重蒸馏，弃去前50mL 馏出液，然后将馏出液收集在带有玻璃塞的玻璃瓶中。

将发酵液样品于4000r/min 下离心5min，吸取上清液1mL，依次加入1mL 含有0.001mol/L 亚硝基铁氰化钠的0.5mol/L 苯酚溶液和1mL 含有0.03mol/L次氯酸钠的0.625mol/L 氢氧化钠溶液，60℃保温5min，于625nm 波长下测吸光度［18］。

配制5mmol/L 氯化铵溶液，分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0mL 溶液于4mL 比色皿中，用无氨水稀释至1.0mL，按上述步骤测定吸光值，绘制标准曲线(图1)。

图1 氯化铵标准曲线Fig.1 Standard curve of ammonium chloride

1.2.2.3 发酵液SCFA 测定 将盲肠内容物发酵液样品在4000r/min 转速下离心15min，吸取上清液转移至超纯水预处理过的10mL 离心管中，10000r/min转速下继续离心15min，1mL 一次性注射器吸取上清液1mL，0.22μm 滤膜过滤至2mL 进样小瓶中待测［19］。

气相色谱条件:进样量1μL;进样口温度220℃;柱流量0.95mL/min，柱温90℃、平衡时间0.5min，5℃/min 升温至150℃，保留时间7min;检测器温度230℃;氢气流量40mL/min，空气流量400mL/min，尾吹流量40mL/min［20］。

1.2.2.4 发酵液微生物测定 取发酵液1mL，加入9mL 无菌生理盐水，依次10 倍稀释至10-7。选择10-5、10-6、10-7三个稀释度，用于大肠杆菌、双歧杆菌和乳酸杆菌的培养计数，接种量为100μL。大肠杆菌培养选用EMB 培养基，37℃下恒温培养箱中培养48h 计数。双歧杆菌和乳酸杆菌分别选用BS 培养基和LBS 培养基，将培养皿蜡封后，37℃下二氧化碳细胞培养箱中厌氧培养72h 计数。结果以lg cfu/mL 表示。

1.3 统计分析

统计学分析用SPSS17.0 软件进行，实验结果以平均值±标准差表示，各组结果采用Duncan 显著性差异测验进行单向方差分析，显著水平为0.05，极显著水平为0.01。

2 结果与分析

2.1 辣椒素对肠道菌发酵液pH 的影响

辣椒素剂量对肠道菌体外发酵液pH 的影响结果见图2。

图2 辣椒素剂量对发酵液pH 的影响Fig.2 Effect of capsaicinoids on pH value in fermentation liquids

从图2 可以看出，添加辣椒素升高了发酵液的pH，并且pH 的升高与辣椒素添加剂量呈正相关。与空白组相比，添加0.15%辣椒素组发酵液pH 显著升高(p ＜0.05)。影响发酵液pH 的主要是发酵产生的有机酸和游离氨，pH 升高表明发酵液中有机酸含量可能降低或游离氨浓度升高。

2.2 辣椒素对肠道菌发酵液游离氨含量的影响

辣椒素剂量对肠道菌体外发酵液中游离氨浓度的影响结果见图3。

图3 辣椒素剂量对发酵液游离氨浓度的影响Fig.3 Effect of capsaicinoids on free ammonia concentration in fermentation liquids

从图3 可以看出:辣椒素提高了肠道菌发酵液中游离氨的浓度，且随着辣椒素添加量的增大，游离氨浓度相应增高，表现明显剂量效应。与空白组比较，添加0.10%和0.15%辣椒素剂量组的发酵液中游离氨浓度都显著升高(p ＜0.05)，其中添加0.15%辣椒素组比空白组高出20%，达到了极显著水平(p ＜0.01)。这与发酵液中pH 的升高相一致。

2.3 辣椒素对肠道菌发酵液中短链脂肪酸的影响

辣椒素剂量对肠道菌体外发酵液中短链脂肪酸浓度的影响结果见图4。从图中可以看出:辣椒素的添加显著降低了发酵液中总SCFA 以及乙酸、丙酸和丁酸的含量(p ＜0.05)，并且有明显的剂量效应关系。辣椒素添加量0.10%和0.15%两组发酵液中短链脂肪酸含量极显著降低(p ＜0.01)。此结果表明，添加辣椒素会导致肠道发酵中有机酸的产生量降低，这可能是由于它抑制了肠道益生菌对碳水化合物的发酵。

图4 辣椒素剂量对发酵液中短链脂肪酸浓度的影响Fig.4 Effect of capsaicinoids on the concentration of SCFA in fermentation liquids

2.4 辣椒素对肠道菌发酵液微生物的影响

辣椒素剂量对肠道菌体外发酵液中乳酸杆菌、双歧杆菌和大肠杆菌生长的影响结果见图5～图7。从图5、图6 中可以看出:随着培养液中辣椒素添加量的增加，发酵液中乳酸杆菌、双歧杆菌的数量显著降低，并表现出明显的剂量效应关系。与空白组相比，培养基中添加0.05%辣椒素就会显著抑制乳酸杆菌的生长(p ＜0.05)，当辣椒素添加量增加到0.15%，乳酸杆菌和双歧杆菌数量极显著减少(p ＜0.01)。观察图7 可知:随着辣椒素剂量增加，发酵液中大肠杆菌数量明显升高，与空白组比，添加0.15%辣椒素的发酵液中大肠杆菌数量的增加达到了极显著水平(p ＜0.01)。

图5 辣椒素剂量对发酵液中乳酸杆菌的影响Fig.5 Effect of capsaicinoids on the amount of Lactobacillus in fermentation liquids

3 结论与讨论

正常人体大肠中含有约1013～1014个微生物，它们对维持肠道正常的生理功能具有重要作用。肠道中SCFA 产量、pH、氨和苯酚浓度、次级胆汁酸产量和肠道微生物活性都与肠道健康息息相关，而肠道微生物组成和活性直接影响SCFA、游离氨和次级胆汁酸的浓度。有研究表明，肠道菌群严重失调(双歧杆菌下降，大肠杆菌、梭菌大量繁殖)，尿素合成受阻，会产生更多的氨［21-22］。在游离氨浓度升高和短链脂肪酸浓度下降的综合作用下，盲肠内容物pH 升高，pH的改变反过来影响盲肠内容物中微生物的生长。

图6 辣椒素剂量对发酵液中双歧杆菌的影响Fig.6 Effect of capsaicinoids on the amount of Bifidobacterium in fermentation liquids

图7 辣椒素剂量对发酵液中大肠杆菌的影响Fig.7 Effect of capsaicinoids on the amount of Enterobacter in fermentation liquids

在机体中未消化的多糖、低聚糖、蛋白质、肽和糖蛋白等食物残渣进入大肠，被肠道微生物进一步分解发酵，糖类发酵产生乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸和气体(CO2、CH4、H2等)，含氮化合物被微生物发酵产生游离氨、苯酚等产物。因此，进入大肠的食物残渣成分直接影响肠道发酵产物和肠道菌群分布。膳食纤维多为益生因子，有利于肠道中乳酸菌、双歧杆菌的生长，产生丰富的SCFA，改善肠道pH，促进肠细胞生长，抑制结肠癌等。Soile M.Gråsten 等研究表明，高膳食纤维的黑麦面包可以增加绝经期妇女肠道微生物活性，提高β-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶和脲酶的活性，促进肠道蠕动，增加排便量和粪便中短链脂肪酸的浓度，而对肠道微生物的组成没有任何不利影响［23］。

本研究结果表明，辣椒素能抑制有益微生物乳酸杆菌、双歧杆菌的繁殖，降低SCFA 产量，提高游离氨浓度，升高pH，进而提供有利于有害菌大肠杆菌生长的环境。辣椒素对肠道健康有一定的不利作用，可能会损害肠道健康，且这种损害与摄入剂量呈正相关，因此在日常饮食中控制辣椒的摄入量是十分必要的。此外，我国食辣人群众多，通过添加肠道益生因子、调整膳食组成，以缓解或改善食用辣椒引起的肠道损伤具有广泛的社会意义，值得进一步深入研究。

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