张 慧， 徐 海，， 况媛媛， 宋 波， 陈龙正， 袁希汉

(1.南京农业大学园艺学院，江苏 南京 210095;2.江苏省农业科学院蔬菜研究所，江苏 南京 210014)

不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis)起源于中国，在全国各地区尤其是南方广泛栽培，是国内重要的绿叶菜之一［1］。根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woronin)侵染引起的一种世界性病害，可导致十字花科作物根和茎吸收传导养分受阻，生长不良，萎蔫、矮化，产量和质量受损，以致减产，造成巨大经济损失［2-3］。近年来，由于不结球白菜栽培效益好，复种指数高，土传病害逐渐成为制约不结球白菜发展的重要因素，根肿病由过去不常见的病害逐渐显露出来，并呈蔓延趋势。

目前，抗根肿病分子标记研究主要集中在结球白菜和甘蓝上，在这些研究中，分别利用RAPD及RFLP等标记确定了与抗性有关的QTL［4］。在结球白菜上已经对抗根肿病基因位点进行了定位和基因图谱的绘制。抗性遗传研究发现，不同的生理小种抗性遗传机制不同［5］。甘蓝苗期根肿病抗性遗传规律结果表明，抗病性受3对以上基因控制，为不完全隐性［6］;而一些研究结果表明B.napus的根肿病抗性是由1～2个独立的显性基因所控制，这些显性基因在大量抗性材料中都存在［7-9］。

由于不结球白菜根肿病为土传病害，不易控制，目前关于不结球白菜根肿病方面的研究鲜有报道。因此开发抗根肿病特异分子标记，对提高育种效率及开展分子标记辅助育种具有重要意义。本研究利用引自结球白菜根肿病抗源，与不结球白菜进行亚种间杂交，构建分离群体，试图筛选出抗根肿病特异分子标记，并鉴别回交后代材料的根肿病抗性，为分子标记辅助育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

2010年，从韩国园艺研究所引进1份结球白菜抗根肿病材料，其对根肿病表现为高抗。利用江苏省农业科学院蔬菜研究所十字花科项目组不结球白菜研究材料T青做父本进行转育，得到F1代。2011年春，将双亲及F1代种植于江苏省农业科学院蔬菜研究所实验田。对F1代植株进行自交，得到F2代，F1代单株与不结球白菜亲本回交，得到BC1代。田间管理按常规方法进行。

1.2 方法

1.2.1 各世代植株抗性鉴定 供试材料:T青、结球白菜抗源 CR、F1、F2及 BC1。每个材料3次重复，每次重复30株，随机排列，播种于50孔穴盘。

待苗长到3～4片真叶时移栽营养钵，采用灌根法进行抗性鉴定。用移液器吸取1 ml含5×107或1×108个孢子悬浮液10 ml，浇注到寄主根际周围，接菌6周后，洗净根部泥土，调查单株发病情况，并计算病情指数。田间病情分级参考前人研究分级标准［3］，略有改动。分级标准为:0级，未发生病害;1级，根系的须根、侧根有较少细小肿瘤，主根未发生病害;2级，根系的须根肿瘤多，侧根肿瘤较多，主根发病较轻，微微肿大;3级，根系的主根发病较重，异常肿大，大部分须根、侧根肿瘤多;4级，根系的主根异常肿大，根系几乎无须根。0级为抗病，其他均为感病。

1.2.2 DNA提取与检测 采用CTAB法提取幼嫩叶片DNA。利用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和纯度，用紫外分光光度计检测DNA质量和浓度，并稀释至 15 ng/μl。

1.2.3 抗感池的构建及引物筛选 采用BSA法，在F2群体中分别随机选取10株抗病单株和10株感病单株，将其DNA等量混合，构建抗病基因池和感病基因池，对引物进行筛选，挑选在抗、感病池间能够产生特异性条带的引物。

1.2.4 PCR反应体系及反应程序 ISSR反应体系的总体积为20 μl，包括1 ×PCR buffer，模板 DNA 30 ng，Taq 酶 1 U、dNTP 250.00 μmol/L、引物 0.25 μmol/L、Mg2+2.5 mmol/L。

ISSR反应程序为94℃预变性5 min;94℃变性1 min，52 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min 30 s，循环35次;72℃延伸10 min，扩增产物4℃保存。

1.2.5 琼脂糖电泳分离 反应结束后，PCR产物点入含0.5 μg/ml EB的2.0% 琼脂糖凝胶中，以DNA marker V(Tiangen)作为分子量标准，在2.0%琼脂糖凝胶中电泳1 h，紫外凝胶成像仪下照相。

1.2.6 ISSR标记的连锁分析 将筛选出的 ISSR标记在双亲及F2分离群体中进行验证，用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。亲本为抗病有标记带和感病无标记带，F1代为感病有标记带，F2代中重组型个体为抗病无标记带、杂合感病无标记带和纯合感病有标记带，根据F2代中重组型单株的数量计算交换率，再根据Kosambi作图函数公式换算成Morgan遗传距离。

2 结果

2.1 抗根肿病群体抗性鉴定

表1 亲本、F1、F2和BC1群体对根肿病的抗性Table 1 Resistance to clubroot in parental lines，F1，F2and BC1

2.2 分子标记的筛选

用90条ISSR引物进行亲本PCR扩增，其中21条ISSR引物可以在亲本间稳定扩增出清晰多态性条带，占总引物数的23.0%。将能够扩增到清晰多态性条带的引物在抗感池中筛选，结果发现，引物873(5'-GACAGACAGACAGACA-3')可以在抗感基因池中扩增出多态性条带，差异片段分别约为500 bp(图1)。

图1 引物873对亲本和抗感DNA池的PCR电泳图谱Fig.1 The electrophoresis pattern of parents and DNA pools by primer 873

由于抗根肿病基因是显性基因，如果标记与抗病基因紧密连锁，纯合抗病株和杂合抗病株都能扩增出此带，而纯合感病株应没有此带。利用F2分离群体中的73个单株DNA对候选引物进一步验证，结果(图2)显示，标记873在54份高抗根肿病单株(抗性0级)中，53个扩增出差异条带，1个未扩增出差异条带。同样19份感病单株中，有6份扩增产生特异条带。因此共有7株在标记873与抗病基因之间发生重组，交换率为9.59%。依据Kogambi作图函数公式得出标记873与抗根肿病基因之间的遗传距离为9.72 cM，命名为CR-873。

图2 引物873对F2部分单株的扩增图谱Fig.2 The PCR pattern of individuals of F2by primer 873

3 讨论

根肿病抗性(Clubroot resistance，CR)的遗传机制研究主要集中在白菜、甘蓝、甘蓝型油菜这3类芸薹属作物中。Laurens等认为，甘蓝的根肿病抗性由许多主效的等位基因所控制，这些等位基因是不完全显性的，并具有明显的加性遗传效应［10］。Voorrips等认为控制甘蓝根肿病抗性的基因都是隐性基因［11］。在B.rapa中发现了至少3个主要的根肿病抗性基因，这些基因是相对独立的，且分别对不同的P.brassicae 生理小种发生作用［12-14］。Diederichsen等利用ECD04和DH群体发现了B.napus根肿病抗性由1个主效基因和至少2个隐性基因控制［15］。王芳展等认为，B.rapa大多数抗性基因都来自于欧洲饲料芜菁，不同的品种获得了1个或者多个的抗性基因，而这些基因之间又相对保持独立［16］。本研究通过对抗根肿病多世代群体进行抗性鉴定表明，不结球白菜抗性由显性单基因控制。

Matsumoto等发现了2个RFLP标记与1个CR基因CRa连锁，并将其定位在 R3染色体34 cM的位置上［17］。Suwabe等利用 SSR标记，发现了Crr1和Crr2 2个CR位点［18］。Kuginuki等利用Siloga作为抗源，发现了3个RAPD标记与CR位点连锁［19］。ISSR技术可以比RFLP、SSR、RAPD等技术更多地揭示基因组中的多态性，并比RAPD稳定，比AFLP简便，是一种很好的DNA指纹标记。本研究采用BSA和ISSR技术相结合来研究与不结球白菜抗根肿病基因连锁的标记，得到1个与根肿病抗性基因连锁较紧密的分子标记CR-873，遗传距离为9.72 cM。本研究中得到的CR-873标记与抗根肿病基因的遗传距离仍然较远，可能是因为本研究中用于计算遗传距离的群体偏小，一定程度上影响遗传距离的准确性。后续研究可以进一步扩大群体并把获得的可能与抗根肿病基因相连锁的ISSR标记转换为更稳定的SCAR标记。

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