李碧侠， 赵 芳， 付言峰， 王学敏， 方晓敏， 涂 枫， 任守文， 王金玉

(1.扬州大学动物科学技术学院，江苏 扬州 225009;2.江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏 南京 210014)

沉默信息调控子Sir2(Silent information regulator 2)是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的组蛋白脱乙酰酶，参与异染色质的基因沉默、DNA修复、基因组稳定性和低等生物寿命的调控［1-3］。在各物种中发现的Sir2同源蛋白统称为Sirtuins家族，哺乳动物的Sirtuins家族有7个成员(SIRT1～SIRT7)，其中 SIRT1与Sir2的同源性最高，因而受到广泛关注。对小鼠和人的SIRT1基因研究发现，SIRT1基因在机体内通过对几种控制代谢及内分泌信号的转录因子去乙酰化作用来调节能量代谢［4-5］。随后研究发现，SIRT1与生殖激素分泌存在较大相关性，直接或间接参与生殖调控［6-7］。SIRT1基因在调节多种转录活性中以一种组织特异性方式发挥作用，提示SIRT1基因的表达在哺乳动物生理学方面具有广泛效应。

目前关于猪SIRT1基因的研究报道很少，猪作为一个良好的动物模型，在研究能量代谢、生殖激素调控等方面发挥重要作用。卵巢颗粒细胞是目前广泛用于相关基因研究最有效且成熟的细胞模型。雌激素是促进卵泡发育成熟、排卵不可缺少的调节因素。因此，本研究拟分析激活剂白黎芦醇和抑制剂尼克酰胺诱导SIRT1基因mRNA表达量的变化对猪卵巢颗粒细胞分泌雌激素的影响及两者间的相关性，将有助于更好地研究SIRT1基因在猪卵巢卵泡发育和发情排卵中的作用，为更深入地研究SIRT1基因影响猪生殖调控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验猪由江苏省农业科学院六合苏钟猪原种场提供，均为苏钟猪成年母猪。采集新鲜健康的猪卵巢，置于37℃生理盐水(添加青霉素和链霉素)中，2 h内带回实验室，用PBS清洗卵巢3～4次，选择直径为3～5 mm的卵泡进行颗粒细胞采集。

1.2 试验方法

1.2.1 主要仪器和试剂 Trizol试剂盒为Invitrogen公司产品，M-MLV reverse transcriptase为Promega公司产品，DMEM/F-12液体培养基、新生胎牛血清、DPBS为GIBCO公司产品，无 RNase的 dNTPMixture、Buffer、SYBR premix ex Taq TM 为 TaKaRa公司产品，猪雌激素酶联免疫分析试剂盒购自凯基公司。仪器有Bio-Rad Iq5型荧光定量PCR仪、SZ-51连续变倍体视显微镜、Leica倒置荧光显微镜和BIO-RAD电泳凝胶成像系统。

1.2.2 颗粒细胞的原代培养 选择直径为2～6 mm的大卵泡，用一次性注射器抽取卵泡液，将卵泡液打入15 ml离心管中，离心，弃上清，加入适量PBS悬浮细胞，并吹打至散，离心，取适量DMEM/F-12将细胞冲至悬浮，并吹打均匀，细胞计数，调整密度至106CFU/ml;接种于25 ml培养瓶中，每个培养瓶加2～3 ml DMEM/F-12培养基，做好标记，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，12 h后观察细胞贴壁情况，24 h后换液，待细胞密度达90%时将细胞传代。体外培养的猪卵巢颗粒细胞密度达80%时将培养液更换为DMEM/F-12培养液(激活剂白黎芦醇或尼克酰胺剂量分 别 为 10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、75 μmol/L、100 μmol/L)，空白对照所用的 DMEM/F-12添加与激活剂剂量相等的DMSO(二甲基亚砜)，培养24 h后，采用qRT-PCR技术对猪卵巢颗粒细胞SIRT1基因的mRNA进行定量分析。每种处理重复3次。收集细胞培养液进行雌激素浓度测定。

1.2.3 SIRT1 mRNA表达量的检测 根据GenBank中公布的猪SIRT1基因序列设计引物，扩增片段长度为130 bp，上游引物序列为:5'-ATTCTTGTGAAAGTGATGAGGATG-3'，下游引物序列为:5'-ATTGTTCGAGGATCTGTGCC-3'。管家基因GAPDH的上游引物序列为:5'-TGAAGGTCGGAGTGAACGGAT-3'，下游引物序列为:5'-TGGGTGGAATCATACTGGAAC-3'，扩增片段长度为148 bp。引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。利用Trizol法提取猪卵巢颗粒细胞总RNA，利用紫外分光光度计检测RNA质量和浓度，进行反转录和RT-PCR扩增。

目的基因、管家基因荧光定量PCR程序均为:反应总体积为25.0 μl，包括SYBR premix ex Taq TM 12.5 μl，上、下游正反引物(10 μmol/L)各 0.5 μl，去离子水10.5 μl。设无模板对照。采用两步法，反应条件均为:94℃ 预变性10 s;然后94℃ 10 s，58℃ 20 s，72℃ 15 s，35个循环。具体方法参照参考文献［8］。

1.2.4 雌激素浓度的检测 采用猪雌激素酶联免疫分析试剂盒检测培养液中雌激素的浓度，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)，制定标准曲线，标准曲线的结果经Logit换算成直线，用直线回归的方法算出直线方程，再根据此方程计算出每一样品的激素含量。

1.2.5 统计分析 数据采用SPSS13.0软件进行差异显著性和相关性分析。

2 结果

2.1 不同浓度白黎芦醇、尼克酰胺对猪卵巢颗粒细胞中SIRT1 mRNA表达量的影响

采用qRT-PCR方法检测不同浓度白黎芦醇、尼克酰胺对猪卵巢颗粒细胞中SIRT1 mRNA表达量的影响，结果表明，随着白黎芦醇浓度的升高，SIRT1 mRNA表达量逐渐增多，达到最高值后逐渐下降;相反，随着尼克酰胺浓度的升高，SIRT1 mRNA表达量逐渐减少。培养液中白黎芦醇浓度低于25 μmol/L及以下时，处理组颗粒细胞中SIRT1 mRNA表达量与空白对照组无显著差异;白黎芦醇浓度达到50 μmol/L及以上时，处理组颗粒细胞中SIRT1 mRNA表达量极显著或显著高于空白对照组(图1A)。培养液中尼克酰胺浓度达到50 μmol/L及以上时，处理组颗粒细胞中SIRT1 mRNA表达量极显著低于空白对照组(图1B)。

图1 含不同浓度白黎芦醇、尼克酰胺的DMEM/F-12培养液培养的猪卵巢颗粒细胞中SIRT1 mRNA的相对表达量Fig.1 SIRT1 mRNA expression levels in porcine ovarian granulosa cells cultured in DMEM/F-12 with different concentrations of resveratrol and nicotinamide

2.2 不同浓度白黎芦醇、尼克酰胺对猪卵巢颗粒细胞分泌雌激素的影响

采用猪雌激素酶联免疫分析试剂盒检测颗粒细胞培养液中雌激素的浓度。随着白黎芦醇浓度的升高，培养液中雌激素浓度逐渐升高，达到最高值后，逐渐下降(图2A);相反，随着尼克酰胺浓度的升高，培养液中雌激素浓度逐渐减少(图2B)。这与颗粒细胞中SIRT1 mRNA表达量规律性相同。培养液中白黎芦醇和尼克酰胺浓度在25 μmol/L及以下时，处理组与空白对照组中雌激素分泌量没有显著差异;当浓度达到50 μmol/L及以上时，处理组中雌激素分泌量与空白对照组存在极显著或显著差异。

图2 含不同浓度白黎芦醇、尼克酰胺的DMEM/F-12培养液培养的猪卵巢颗粒细胞中雌激素分泌量Fig.2 Estrogen levels in porcine ovarian granulosa cells cultured in DMEM/F-12 with different concentrations of resveratrol and nicotinamide

2.3 猪卵巢颗粒细胞中SIRT1 mRNA表达量与其分泌雌激素的相关性

统计分析结果表明，猪卵巢颗粒细胞中SIRT1 mRNA表达量与雌激素分泌量存在正相关，相关系数为0.966 8(图 3)。

图3 猪卵巢颗粒细胞中雌激素含量与SIRT1 mRAN相对表达量间的关系Fig.3 Correlation between estrogen level and SIRT1 mRAN expression level in porcine ovarian granulosa cells

3 讨论

SIRT1是一种二氢尿嘧啶脱氢酶依赖的具有去乙酰化酶活性的多功能转录调节因子，通过组蛋白/非组蛋白去乙酰化，广泛参与调控哺乳动物脂肪代谢、糖代谢、胰岛素分泌等多条信号代谢通路，调节基因转录、能量代谢及细胞衰老［9-12］。近几年研究发现，人和小鼠的SIRT1基因与卵巢中孕酮、雌激素分泌存在密切相关性［13］。雌性小鼠双侧卵巢切除模型研究发现，多种组织中SIRTl蛋白表达量均明显减少，在卵巢、心脏、主动脉和骨骼肌中减少的尤为明显;同时发现，SIRT1敲除的雌性小鼠卵巢颗粒细胞分泌雌激素水平显著降低［14］，但猪SIRT1基因对生殖激素分泌的影响研究尚未见报道。

本研究首次报道了猪卵巢颗粒细胞中SIRT1基因量的变化对颗粒细胞分泌雌激素的影响。qRTPCR结果表明，随着白黎芦醇浓度升高，SIRT1 mRNA表达量逐渐上升，白黎芦醇浓度达到50 μmol/L时，SIRT1 mRNA表达量最高，但随后由于白黎芦醇浓度的增大，颗粒细胞出现凋亡，SIRT1 mRNA表达量开始下降;相反，随着尼克酰胺浓度升高，SIRT1 mRNA表达量逐渐降低。上述结果说明白黎芦醇可有效促进猪卵巢颗粒细胞中SIRT1 mRNA的表达，而尼克酰胺则抑制SIRT1 mRNA表达。分析不同处理的颗粒细胞培养液中雌激素变化规律，结果发现雌激素变化规律与颗粒细胞中SIRT1 mRNA表达规律一致。两者相关分析表明，SIRT1 mRNA表达量与雌激素分泌量存在较强的正相关。该结果初步说明猪卵巢颗粒细胞中SIRT1 mRNA表达量影响颗粒细胞分泌雌激素的能力，具体调控机制需进一步研究。

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