李 敏， 张 健， 王奎山， 李玉娟， 谈 峰， 王 莹

(江苏沿江地区农业科学研究所，江苏 如皋 226541)

大多数高等植物在受到盐、干旱等胁迫时会在细胞内积累大量甘氨酸甜菜碱(简称甜菜碱)来提高自身抵抗逆境环境因子胁迫的能力［1］。甜菜碱作为季胺类水溶性生物碱，具有渗透调节功能，能够保护质膜的完整性，有助于植物适应非生物逆境［2-3］。

耐盐柳树，具有较强的耐盐能力，能在含盐0.4%、pH 10.4的土壤中正常生长，是中国沿海滩涂主要的造林树种之一。耐盐柳树适应性强，易繁殖，造林成活率高，生长迅速，无论在营造工业用材林，还是在防风固沙、水土保持、盐碱地改造等方面都有广阔的应用前景［4］。目前，国内外学者已从川芎(Liqusticum churning Franch Hort)、枸杞(Lycium barbarum)、刺五加(Eleutherococcus senticosus)、甘菊(Dendranthema lavandulifolium)、胡杨(Populus euphratica)、辽宁碱蓬 (Suaeda liaotungensis)、梭 梭(Haloxy lonammodendron)、盐爪爪(Kalidium foliatum)、大麦(Hordeum vulgare L.)、盐穗木 (Halostachys caspica)等［5-14］植物中相继克隆得到甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因，但有关耐盐柳树BADH基因的研究还未见报道。本研究拟从耐盐柳树中克隆BADH基因，探讨其与其他品种或物种同源基因的相似性，构建系统进化树，并对其进行序列分析和在盐胁迫下的表达分析，旨在为耐盐柳树种质改良研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试植物为江苏沿江地区农业科学研究所选育的耐盐柳树L0911，取新鲜叶片，用液氮速冻存于－70℃冰箱待用。

1.2 试剂

引物 Taq DNA聚合酶、dNTP(10 mmol/L)、DNA marker和 PCR产物纯化回收试剂盒(生工SK1141)、质粒提取试剂盒(生工 SK1191 UNIQ-10)、荧光定量PCR用试剂盒(SK8661)、常规化学试剂等均购自上海生工生物工程有限公司，pMD18-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 RNA提取和总cDNA的合成

采用Trizol试剂(Invitrogen公司)参照试剂说明手册提取总RNA。总cDNA的合成用AMV逆转录酶(BBI公司)按照反转录试剂盒说明书进行。

1.4 BADH 基因克隆

根据毛果杨(Populus trichocarpa)的PtBADH设计引物BADH F1:5'-AGCTCTCAACTCACTAATCGAGT-3';BADH R1:5'-TTATAGCTTGGCGGGAGACTG-3'。以L0911叶片总cNDA为模板，PCR产物经1%琼脂糖电泳后，切胶回收，并进行T/A克隆(pMD18-T)。阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序。所得的克隆序列为2次独立PCR和3个以上质粒的测序结果。

1.5 BADH基因的分子进化分析

在GenBank查找BADH基因的核苷酸和氨基酸相关序列，使用 Clustal W2进行多序列比对，MEGA5.0软件中 Neighbor-Joining(NJ)法进行建树，Bootstrap值设为1 000。

1.6 盐处理

将水培生长健壮的柳树L0911幼苗用200 mmol/L NaCl溶液分别处理0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、48 h、72 h后，取新鲜嫩叶片。将 L0911幼苗分别用 0 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L 、300 mmol/L NaCl溶液处理12 h后，取新鲜嫩叶片。所有样品用液氮速冻存于－70℃冰箱待用。

1.7 实时荧光定量PCR分析

根据测序结果，设计引物BADH F2(5'-GTGCCAAGTATTTGCGTGCTA-3')和BADH R2(5'-AAACAACCTGCGACATCATCC-3')，对L0911 BADH基因盐胁迫处理后的响应进行分析。用ubiquitin-like(UBQ-L)［15］为内参基因，引物为 UBQ-L-F(5'-TGAGGCTTAGGGGAGGAACT-3')和UBQ-L-R(5'-T GTAGTCGCGAGCTGTCTTG-3')。将经过盐处理的柳树L0911幼苗嫩叶进行总RNA提取以及cDNA合成。按柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒(SK8661)配制PCR体系，于ABI Stepone plus型荧光定量PCR仪中进行定量PCR检测，测定其Ct值，用 F=2－△△Ct公式［16］计算样品间目的基因的表达量差异。

2 结果

2.1 柳树L0911 BADH基因的克隆

从图1可以看出，引物BADH F1和BADH R1在柳树L0911的cDNA模板中成功扩增到目的片段，长度大小符合预期目标。测序结果表明，L0911的BADH基因cDNA全长1 539 bp，具有起始密码子、完整的开放阅读框(1 512 bp)、终止密码子、5'非编码区(27 bp)，共编码512个氨基酸。获得的氨基酸序列与毛果杨PtBADH2、胡杨PeBADH2编码序列以及拟南芥、水稻的氨基酸序列相似性达到95.83%、95.03%、82.31%、71.68%。说明本试验获得的基因与PtBADH2和PeBADH2是同源的。

图1 引物BADH-F1/R1扩增柳树L0911 cDNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果Fig.1 Amplification of Salix cultivar L0911 cDNA by PCR using primers BADH-F1/R1

2.2 柳树L0911氨基酸序列分析和系统进化树构建

用MEGA 5.0对BADH基因编码的氨基酸序列进行分子进化分析，结果与用基因组序列(www.phytozome.net)分析结果一致。柳树 L0911的BADH基因与杨树位于相同的分支(图2)。在胡杨［9］、白骨壤［17］、麻疯树［18］等植物中，BADH 基因的功能已有报道，本研究获得的BADH可能具有相应的生物学功能。

图2 植物BADH基因编码氨基酸的分子进化分析图Fig.2 Phylogentic tree of BADH gene of various plants based on amino acids sequence

2.3 盐胁迫下柳树L0911 BADH基因的表达分析

2.3.1 不同浓度 NaCl溶液胁迫下柳树L0911BADH基因的表达特性 以未进行NaCl胁迫处理的叶片中BADH基因的表达量为对照，对实时荧光定量中得到的目的基因BADH和内参基因UBQ-L的平均Ct值，计算作图，得到图3。可以看出柳树L0911叶片中BADH基因的表达情况随着盐浓度的升高呈先升高后降低的趋势，在200 mmol/L NaCl胁迫下表达量最高，是对照的1.90倍。说明一定浓度的 NaCl胁迫可以诱导柳树 L0911的BADH基因表达量增加，但盐浓度过高BADH基因表达量又会下降。

图3 不同NaCl浓度胁迫12 h后柳树L0911 BADH基因的表达Fig.3 Expression of BADH gene of Salix cultivar L0911 under NaCl stress for 12 h at different concentrations

2.3.2 NaCl不同胁迫时长下 L0911BADH基因的表达特性 从图4可以看出，随NaCl胁迫时间的延长，叶片中BADH基因表达量呈现先升高后降低的趋势。胁迫初期(3 h)，L0911 BADH基因表达量低于对照;随着时间的延长，表达量逐渐增大，胁迫12 h时达到最高，是对照组的1.88倍，说明盐胁迫能诱导该基因表达量的增加;随着时间进一步延长，表达量逐渐降低，胁迫72 h时表达量低于对照水平。

图4 200 mmol/LNaCl胁迫不同时间柳树L0911 BADH基因的表达Fig.4 Expression of BADH gene of Salix cultivar L0911 under 200 mmol/L NaCl stress for different times duration

3 讨论

植物在干旱、盐碱等逆境条件下可积累大量甜菜碱，而植物体内甜菜碱的合成途径相对简单，主要经两步催化合成，即乙酰胆碱→甘氨酸甜菜碱醛→甘氨酸［19］。甜菜碱合成后不能进一步代谢，积累在细胞中作为永久性或半永久性渗透调节剂［20］。因此，甜菜碱合成途径中的甜菜碱醛脱氢酶(BADH)被认为是最有希望的胁迫抗性基因之一，BADH的分子生物学与生物化学研究引起了广泛关注。本研究从柳树L0911克隆到BADH基因，并对该基因的结构、系统进化、表达模式进行了比较详细的研究。

本研究采用同源克隆法从柳树L0911cDNA中扩增并克隆了BADH基因。测序结果表明，该基因含有1个完整的开放阅读框架，核苷酸序列全长为1 539 bp，推测的氨基酸序列全长为512个氨基酸残基。氨基酸序列同源性分析表明L0911的BADH基因与毛果杨、胡杨等同源性最近，为95%，与水稻的同源性为71%。L0911的BADH氨基酸序列同源性分析也表明BADH在高等植物中是相对保守的。

植物在逆境条件下会积累甜菜碱，BADH基因的表达活性又直接影响甜菜碱的合成。本试验用荧光定量的方法检测柳树L0911在盐胁迫下BADH mRNA的表达情况。结果表明，BADH基因是受盐诱导的，当盐浓度升高至200 mmol/L时，表达活性最大;在同一盐浓度下，随着盐胁迫时间的延长，在一定范围内，表达活性也增大。Arakawa等［21］研究结果表明大麦(Hordeum vulgare)BADH酶活性随着盐浓度的增加而增大;Reda等［22］研究结果也表明盐角草(Salicornia europaea)和碱蓬(Suaeda maritima)的BADH mRNA在盐胁迫下的表达水平增加，本研究结果与他们基本一致。这为进一步揭示L0911的耐盐机制及利用该基因进行遗传工程创造耐盐新种质奠定了基础。

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