基于生物工程的废次烟叶资源化技术研究

2013-07-31周国生义胜辉崔建军杨秋林刘勇军赵松义郑青叶李利龙

中国烟草科学 2013年1期

周国生，义胜辉，崔建军，杨秋林，刘勇军，赵松义，郑青叶，李利龙，向洋*

（1.湖南烟叶复烤有限公司，湖南郴州 432000；2.湖南省烟草公司，长沙 410004；3.长沙理工大学环境工程及生物技术研究所，长沙 410114）

我国每年烟叶产量 200多万t，但对烟叶的利用方式比较单一，至今仍沿袭传统的生产模式，专用于制作卷烟，没有充分发挥其多种功效的生物学特性，把吸用、饲用、药用以及食用产品的开发结合起来，综合加以利用[1-2]。

烟草中含有的烟碱等次生代谢物，不仅是保健品、戒烟膏、治疗关节痛和肌肉痉挛的外用药等产品的原料，而且还可用于生产高效低残留的有机农药，广泛应用于水果和蔬菜等作物作为杀虫剂[3]。废弃的烟草残渣中含多种氨基酸和微量元素，营养成分高，还可用于生产饲料和有机生物肥料等。将烟草饲料作为一种新型节粮饲料，开辟新的饲料资源，缓解人畜争粮矛盾，不失为一种新的选择[4]。

近年来，随着烟叶种植面积、烟叶产量、卷烟产量的逐年增加，卷烟市场对名特优烟叶需求的提高，烟叶废弃资源的总量亦在逐年增加[5]。因此，对废弃烟叶的综合利用提出了更高的要求，不仅仅牵涉到生态环境恶化的问题，而且还是资源合理利用的迫切需求。本研究探索废次烟叶综合利用技术，为提高废次烟叶的利用率提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

废次烟叶中烟梗和烟末由湖南烟叶复烤有限公司提供、烟叶由湖南省烟草公司郴州市公司提供；芝麻饼、豆饼、菜籽饼由当地农户提供；菌种由长沙理工大学向洋教授实验室分离；凤尾菇由湖南省食用菌研究所提供。五月慢种子由南京金盛达种子有限公司提供；空心菜种子由广西柳州市兴旺蔬菜良种经营部提供。药品包括95%乙醇、氢氧化钠、石油醚、无水乙醚、正乙烷、95%～98%硫酸，均为分析纯。培养基为马铃薯培养基[6]。

1.2 废弃烟叶中烟碱的提取及纯化

1.2.1 烟叶的预处理将废弃烟叶置于恒温箱中，在100 ℃下干燥1 h，取出在研钵中粉碎，再置于玻璃干燥器中待用。

1.2.2 浸提液的制备取上述粉碎的烟叶10 g，放在烧杯中用适量的蒸馏水浸泡，并把烧杯放在80℃的水浴锅中，每隔一段时间挤压过滤、换水，继续浸泡。一直到浸泡液呈现淡淡的黄色，烟叶中的烟碱基本上被提取出来，滤渣用蒸馏水多次清洗，并将多次清洗液和浸泡液合并移至250 mL容量瓶中，定容至刻度线。

1.2.3 标准曲线制作标准曲线，所得方程为y=0.1764+2.2918x，r=0.999**，式中y为吸光度，x为烟碱浓度（mg/mL)[7]。

1.2.4 萃取分别用正己烷、石油醚和二氯甲烷萃取，得出最佳萃取剂。每种试剂萃取3次，所用萃取剂与萃取液比值分别为 1∶1、1.5∶1、1.5∶1、2.5∶1、3∶1。通过比较分光光度值，根据1.2.3的标准曲线，确定萃取剂与萃取液的最佳比值。

1.2.5 蒸馏恒温水浴加热萃取液用旋转蒸发仪进行蒸馏，待再次重复使用，剩余物质即是粗烟碱。

1.3 烟碱抑菌杀虫剂的制备及试验

1.3.1 烟草浸出液的制取将预处理后的废弃烟叶5 g置于干燥的烧杯中，并定容至刻度线，得到烟草浸出液。

1.3.2 烟碱稀释液的制备分别取烟草浸出液与蒸馏水混合，得到5个不同浓度的烟碱稀释液。

1.3.3 烟碱对微生物的生长抑制试验将 1.3.2所得烟碱稀释液各取1 mL分别置于5号培养皿中，用1 mL无菌水作对照。将此6个培养皿用马铃薯培养基倒平板，混合均匀，冷却后接入菌悬液 0.1 mL，各做一组平行试验，倒置于28 ℃恒温培养箱中培养2 d，观察抑菌作用。

1.3.4 烟碱对蚜虫的驱杀作用试验将50 mL烟草浸出液装入小型喷雾器中，喷洒约5 mL于长满蚜虫的空心菜叶面，观察1 d驱杀效果。

1.4 利用废次烟草作为食用菌栽培原料试验

试验流程：废次烟草→脱毒→灭菌→接种→培养→观察。

1.4.1 废次烟叶预处理将废弃烟叶置于恒温干燥箱中，于100 ℃条件下烘干30 min，取出粉碎至2mm左右，置干燥处进行脱毒处理。

1.4.2 灭菌将脱毒处理的废次烟叶置于121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.4.3 调节湿度待冷却后，在超净台下调节烟叶残渣的湿度在 60%～65%[8-9]。

1.4.4 接种培养将食用菌菌种接入培养皿中，置于28 ℃恒温培养箱下培养。

1.5 烟梗烟末残渣作为生物有机肥试验

废次烟草→脱毒→接种→培养→检测游离氨基酸。

1.5.1 菌种的扩大培养以芝麻籽:菜籽饼:豆饼，按 6:3:1比例混合均匀，加入适量的水，包扎并灭菌。将CL01-1和CL02-1菌分别接入冷却后的混合料中，培养至混合料基本成为粉状，待用。

1.5.2 废次烟叶预处理将废弃烟叶置于恒温干燥箱中，于100 ℃条件下烘干30 min，取出粉碎至2mm左右，并将上述锥形瓶于121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.5.3 调节湿度待冷却后，在超净台下调节烟叶残渣的湿度在60%～65%。

1.5.4 接种培养分别接入CL01-1和CL02-1菌，置于28 ℃恒温培养箱下培养。

1.5.5 检测氨基酸用高效液相色谱法检测接种培养处理后的废次烟草叶中游离氨基酸量。

1.5.6 肥效试验将上述培养5 d后的废次烟叶在100 ℃进行干燥，杀死菌种并将冷却后的培养料加入空心菜水培液，并将一部分施入五月慢试验地，观察空心菜和五月慢的生长情况。

2 结果

2.1 废弃烟叶中烟碱提取及纯化结果

烟碱提取和纯化试验主要结果见图1～3。从图1可以看出，随着pH的增大，烟碱提取浓度提高。pH值为12时达到最大值，此pH时烟碱提取效果为最好，达0.1857 mg/mL。

3种萃取剂正己烷萃取效果最好，烟碱提取量达 0.1900 mg/mL（图2）。利用正己烷萃取时，分层较快且很明显，易于将水相与有机相分离，不易出现乳化现象。因此，选择正己烷正作为萃取溶剂最为合适。

随着萃取剂用量的增加，烟碱提取率呈上升趋势，当萃取剂∶萃取液为 3∶1时最高，烟碱为0.1489 mg/mL（图3）。

图1 烟碱溶液中烟碱浓度与pH的关系Fig.1 The relationship between nicotinic concentration and pH value in nicotinic solution

图2 不同萃取剂提取效果Fig.2 The effect of extraction agent on nicotinic concentration

图3 不同萃取剂与萃取液比值的提取效果Fig.3 The ratio of extraction agent and the extraction liquid

2.2 烟碱抑菌杀虫效果

与空白对照相比，烟碱对培养皿中微生物的生长繁殖抑制作用非常明显，且烟碱浓度越高，抑制越强（图4）。

图4 不同比例烟碱溶液抑菌效果Fig.4 The inhibition effect of nicotine on the growth of microorganism

图5显示了烟碱对植物蚜虫的驱杀效果，可以看出，在喷洒烟草浸出液之前（图5a），空心菜叶面的蚜虫生命活动旺盛；喷洒后（图5b），蚜虫的生命活动由于受到烟碱的抑制而减慢，生命力减弱，掉落于桌面以致死亡；喷洒烟草浸出液之后置于培养皿中的叶面蚜虫（图5c），也同样出现了死亡的现象。因此，利用烟草浸出液中含有的烟碱在处理蚜虫病害的时候，由于烟碱对蚜虫（虫害）的生命活动的抑制，使得蚜虫（虫害）最终减少和死亡，从而对病虫有着明显的驱杀作用。