樊全荣史俊文贾俊双高飞张余琴赵尊兰姚开泰肖东,2

1.南方医科大学肿瘤研究所，广东 广州 510515；

2.南方医科大学比较医学研究所暨实验动物中心，广东 广州 510515

携带Fluc和ZsGreen双报告基因小鼠iPS细胞系的建立

樊全荣1史俊文1贾俊双1高飞1张余琴1赵尊兰1姚开泰1肖东1,2

1.南方医科大学肿瘤研究所，广东 广州 510515；

2.南方医科大学比较医学研究所暨实验动物中心，广东 广州 510515

背景与目的：诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS细胞)在修复受损组织器官和治疗人类疾病方面已展示了良好的应用前景，但iPS细胞具有形成畸胎瘤的作用，这是其安全应用于临床的巨大障碍之一。为此本研究拟利用慢病毒体外感染的方法，建立携带萤火虫荧光素酶(firefly luciferase，Fluc)和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，ZsGreen)双报告基因的小鼠iPS细胞系，为活体动态监测畸胎瘤形成、定植和形成畸胎瘤所需最小细胞剂量等提供实验基础。方法：构建含Fluc和ZsGreen双报告基因的慢病毒载体。以pLH2BmRFP质粒为模板，PCR扩增获得Fluc基因片段，将其克隆至利用BamHⅠ酶切的pHAGE-fullEF1a-MCS-IZsGreen质粒中，挑选一个阳性克隆质粒进行测序，最终获得携带双报告基因的慢病毒载体pEF1a-Fluc-IRES-ZsGreen(pELZG)。采用脂质体介导的瞬时转染生产携带Fluc和ZsGreen基因的病毒，收集病毒上清，并感染iPS细胞，数天后荧光显微镜下观察是否有绿色荧光的iPS细胞克隆，不断挑取ZsGreen阳性的iPS细胞克隆以进一步纯化。将标记好的iPS细胞移植入裸鼠皮下，观察成瘤情况。结果：pELZG载体分别经XbaⅠ、PvuⅡ、SacⅠ单酶切，得到的片段大小分别为10.005、3.282和6.723 kb，2.441、3.401和6.604 kb，预示成功构建了Fluc和ZsGreen双报告基因的慢病毒载体。利用其生产的病毒上清成功感染iPS细胞，经过不断的纯化，最终获得含稳定表达Fluc和ZsGreen双报告基因的小鼠iPS细胞系。将标记好的iPS细胞植入裸鼠皮下后，观察到畸胎瘤的形成。结论：成功建立了携带Fluc和ZsGreen双报告基因的小鼠iPS细胞系，为相关后续研究打下了良好的基础。标记后的iPS细胞对畸胎瘤的形成和发展具有很好的示踪作用。

萤火虫荧光素酶；绿色荧光蛋白；慢病毒；293T细胞；诱导性多潜能干细胞；畸胎瘤

自日本和美国研究小组先后用4种基因将小鼠和人的体细胞在体外重编程为诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS细胞)以来，iPS细胞的研究和关注度呈爆炸式增长［1-3］。iPS细胞类似于ES细胞，有很强的自我更新和分化能力，使其具有分化成各种组织和器官的潜能，并且目前已成功建立了个体、疾病或患者特异的人iPS细胞系［4］。此类iPS细胞应用于临床，不存在免疫排斥和伦理道德问题。因此，iPS细胞具有十分重要的临床应用价值。但是，iPS细胞自身存在很多不安全因素，要真正应用于临床还有很多问题亟待解决。其中之一就是iPS细胞在体内易形成畸胎瘤。如何简单直观灵敏地检测iPS细胞形成畸胎瘤的细胞剂量，动态活体可视化观察畸胎瘤形成、定植和转归是目前该领域研究的热点之一，而小动物活体成像技术在该研究领域大有用武之地［5］。小动物活体成像技术主要分为光学成像、核素成像、磁共振成像、超声成像和CT成像5大类，其中光学成像主要采用生物发光和荧光两种技术。生物发光成像是用萤火虫荧光素酶(firefly luciferase，Fluc)基因标记细胞，而荧光成像技术则采用荧光报告基团GFP、ZsGreen和RFP等进行标记；生物发光成像灵敏度高、特异性极强、可精确定量、组织穿透力强，而荧光成像虽有背景噪音、灵敏度低和组织穿透力弱等缺点，但荧光信号强、标记靶点多样、观察直观、检测方便。因此，对于不同研究，应根据生物发光成像和荧光成像各自特点和优势进行选择。为综合生物发光和荧光成像的优点，本研究拟借助慢病毒［6-7］将Fluc和ZsGreen双报告基因导入小鼠iPS细胞的基因组内，以获得Fluc和ZsGreen基因标记的小鼠iPS细胞系，为后续iPS细胞畸胎瘤形成研究提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 载体

慢病毒载体pHAGE-fullEF1a-MCS-IzsGreen由美国哈弗医学院的Jeng-Shin Lee博士惠赠；pLH2BmRFP由本课题组构建(内含Fluc基因序列)；慢病毒包装系统psPAX2和pMD2.G由瑞士Didier Trono博士惠赠。

1.1.2 主要试剂

限制性内切酶、感受态、胶回收试剂盒和连接试剂盒均购于宝生物工程(大连)有限公司，脂质体LipofectamineTM2000、Opti-MEM®Ⅰ Medium、高糖DMEM、澳洲胎牛、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、2-Mercaptoethanol、Sodium Pyruvate、LIF、胰蛋白酶和DMSO等购自Invitrogen公司，培养板及培养瓶等购自Corning公司。

1.1.3 细胞

293T细胞购自Invitrogen公司，饲养层细胞由本课题组原代培养得到，小鼠iPS细胞购自SBI公司。

1.1.4 动物

4～5周龄裸鼠购自广州省医学实验动物中心，ICR鼠购自广州赛业生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 构建携带Fluc和ZsGreen双报告基因的慢病毒载体

⑴引物设计和合成：利用Pubmed Primer blast软件，根据已知的Fluc序列设计引物(表1)。将设计好的引物送至大连宝生物工程有限公司合成。

⑵目的片段的扩增：使用 PrimeSTAR®HS DNA Polymerase (Code No.DR010S)扩增。反应体系：pLH2BmRFP 1 μL，5×PrimeSTAR Buffer (Mg2+plus) 10 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)4 μL，Fluc-F (5 pmol/μL) 0.5 μL，Fluc-R(5 pmol/μL) 0.5 μL，PrimeSTAR HS DNA聚合酶(2.5 U/μL) 0.5 μL，再加ddH2O至50 μL。反应条件：98 ℃变性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸2 min，共30个循环。然后72 ℃延伸5 min。使用 TaKaRa Agarose Gel DNA纯化试剂盒Ver.2.0(CodeNo.DV805A)切胶回收目的片段Fluc。取 1 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳。

表 1 Fluc序列设计引物Tab. 1 Primers for Fluc reporter gene amplified by PCR

⑶重组质粒的构建：将质粒pHAGE-fullEF1a-MCS-IzsGreen用BamH Ⅰ酶切。反应体系：pHAGE-fullEF1a-MCS-IZsGreen 10 μL，10×Buffer 5 μL，BamH Ⅰ(10 U/μL)1.5 μL，再加ddH2O至50 μL。在37 ℃进行酶切4 h。使用TaKaRa Agarose Gel DNA纯化试剂盒Ver.2.0(Code No.DV805A)切胶回收载体片段，得到连接用载体片段。使用In-Fusion®HD克隆试剂盒(Clontech Code No.639633)，将目的片段Fluc和连接用载体片段连接。连接体系：目的片段Fluc (约50 ng/μL)1 μL，连接用载体片段(约80 ng/μL)1 μL，5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2 μL，加ddH2O至10 μL。连接条件：50 ℃，15 min。将连接产物取1 μL热转化至E. Coli Competent Cell JM109 (Code No. D9052)中，涂布平板，37 ℃过夜培养。挑取阳性克隆，酶切及测序鉴定后，得到pEF1a-Fluc-IRESZsGreen(pELZG)质粒。

1.2.2 制备携带Fluc和ZsGreen双报告基因的慢病毒

复苏293T细胞，在转染前1天将其传到25 cm2的培养瓶中，密度保证第2天达90%。转染时，将培养瓶中的培养基换成170 μL的Opti-MEM，先把LipofectamineTM2000 17 μL加到500 μL Opti-MEM中，为B液，静置5 min；同时将慢病毒载体pELZG和包装质粒psPAX2及pMD2.G按一定比例加到另一管500 μL Opti-MEM中，为A液。接着将A液加到B液中，将其充分混匀，室温放置20 min，然后把A液和B液混合物加到培养瓶中。转染6～8 h更换成新鲜的培养基。转染48～72 h后，在倒置荧光显微镜下观察细胞发光情况，并适时拍照。确认转染成功后，收集含病毒的细胞培养液，3 000×g离心15 min去除细胞碎片，取上清液，分装，-80 ℃冻存备用。用收集的病毒上清液感染293T细胞，检测病毒是否成功生产。

1.2.3 慢病毒感染iPS细胞

选取对数生长期的iPS细胞，胰酶消化制成单细胞悬液，利用差速贴壁法分离iPS细胞和饲养层细胞。对分离后iPS细胞计数，以每孔1×105个的密度接种到无饲养层细胞的24孔板中。第2天待细胞贴壁后加入含病毒上清液和转染增强剂polybrene (2 μg/mL)的完全培养基。放入培养箱中培养。6～8 h后换成新鲜的完全培养基继续培养，第2天将细胞用胰酶消化，重新铺到事先准备好的饲养层细胞上。感染后48～72 h，利用倒置荧光显微镜和小动物活体成像仪分别检测ZsGreen和Fluc基因表达。

1.2.4 裸鼠皮下成瘤实验

选取对数生长期的携带ZsGreen和Fluc基因的iPS细胞，用胰酶消化将其吹打成单细胞悬液，利用差速贴壁法将iPS细胞和饲养层分开，对分离后的iPS细胞计数。取1只4～5周龄的裸鼠，将分离后的iPS细胞注射进裸鼠皮下，选取部位和注射剂量分别为：左上胸部，1×106个/100 μL；右下腹部，5×105个/100 μL。密切观察肿瘤生长情况，1个月后取材。取材前，利用小动物活体成像仪检测肿瘤Fluc基因的表达情况；将肿瘤取出后，在体视荧光显微镜下观察是否见绿色荧光。

1.2.5 肿瘤组织切片HE染色

将部分肿瘤组织放入4%多聚甲醛溶液固定2～3 d后取出，冲水2 h，接着放入自动脱水机内脱水，然后进行包埋。将制备好的蜡块用组织切片机切片，切片放入65 ℃烤箱中烘烤2 h，最后将切片放入自动染色机内染色。染色完毕后，在显微镜下观察。

2 结 果

2.1 携带Fluc和ZsGreen双报告基因慢病毒载体的构建

在泛表达启动子EF1a的下游和报告基因ZsGreen之间插入Fluc基因片段，获得携带双报告基因的慢病毒载体pEF1a-Fluc-IRESZsGreen，命名为pELZG，其载体结构图(图1A)。以质粒pLH2BmRFP为模板，以Fluc-F/ Fluc-R特异引物进行PCR扩增(图1B)，由电泳图可以看出该引物扩增出单一的条带，片段大小为1 650 bp。对该片段大小进行胶回收和纯化，得到Fluc基因DNA。质粒pELZG酶切鉴定结果(图1C)。质粒pHAGE-fullEF1a-MCS-IzsGreen经BamHⅠ单酶切(图1C-1)，得到连接用载体(8.346 kb)；pELZG载体分别经XbaⅠ、PvuⅡ、SacⅠ单酶切(图1C-3、4、5)、得到的片段大小分别为10.005、3.282和6.723 kb，2.441、3.401和6.604 kb。以上结果均与预期结果相符。

2.2 慢病毒包装

慢病毒载体pELZG与病毒包装质粒共转染293T细胞，24 h后倒置荧光显微镜下可见绿色荧光(图2A)，证明转染成功。同时，用收集到的病毒上清液感染293T细胞，24 h后可见绿色荧光(图2B)，证明病毒生产成功。

2.3 慢病毒成功感染iPS细胞

按“材料和方法”部分介绍的方法用携带Fluc和ZsGreen基因的病毒上清液感染iPS细胞。开始时得到掺杂ZsGreen阴性的iPS细胞克隆，经过多次挑取阳性克隆后，得到100%的ZsGreen阳性的细胞克隆，然后用小动物活体成像仪检测iPS细胞Fluc的表达，成功构建了稳定表达Fluc和ZsGreen双报告基因的iPS细胞系(图3)。

图 1 pELZG载体构建与鉴定Fig. 1 The construction and identification of pELZG vector

图 2 制备携带Fluc和ZsGreen基因的慢病毒Fig. 2 Preparation and identification of lentiviral carrying the Fluc and ZsGreen genes

图 3 携带Fluc和ZsGreen基因的慢病毒感染iPS细胞Fig. 3 The lentivirus carrying Fluc and ZsGreen genes infected iPS cells

2.4 经Fluc和ZsGreen基因遗传修饰的iPS细胞体内分化潜能

基于裸鼠皮下畸胎瘤形成实验验证，经Fluc和ZsGreen基因遗传修饰的iPS细胞是否仍具有多向分化潜能。携带Fluc和ZsGreen基因的iPS细胞接种到裸鼠皮下1周左右，开始出现肿瘤块；4周时瘤块约为1.2～10 cm3(图4A)。 取材前，小动物活体成像仪检测到肿瘤组织中Fluc基因表达(图4B)；取出后的瘤块组织置于体视荧光显微镜下，可见绿色荧光(图4C)。

瘤块组织的石蜡块经切片做HE染色，显微镜下观察可见3个胚层来源的组织，如上皮样结构(图4D-a)、肺泡(图4D-b)和脂肪(图4D-c)等，这些符合畸胎瘤的分化特点。可见经Fluc和ZsGreen基因遗传修饰的iPS细胞具有形成畸胎瘤的作用，即携带Fluc和ZsGreen基因的小鼠，iPS细胞仍然保留多向分化潜能。

图 4 裸鼠畸胎瘤荧光检测及HE染色Fig. 4 The fluorescence detection and HE staining of the teratoma formed in nude mice.

3 讨 论

通常，如借助慢病毒将外源基因导入胚胎干细胞或iPS细胞，需用浓缩后的病毒感染这些细胞，这就需大量生产慢病毒，接着收集病毒上清，并经超速离心机浓缩，该方法费时、费力、费钱［8］；本实验利用病毒上清液直接感染iPS细胞，取得了理想的感染效果，避免了繁琐的病毒浓缩，不仅省时、省力，而且经济实惠。

iPS 细胞的分化潜能使其可以在体内和体外分化成各种功能细胞，而利用iPS细胞和其分化得到的功能细胞对损伤的组织进行修复，即所谓的iPS细胞替代治疗［9-12］。iPS细胞移植在临床上治疗某些组织器官死亡或功能衰竭具有很大的潜力，iPS细胞虽然避免了免疫排斥的风险，但是还存在很多不安全因素，比如在受者体内容易形成畸胎瘤。畸胎瘤的产生不仅不能完成移植的既定目标，还对机体造成了更大的损伤。iPS细胞及其衍生而来的细胞移植形成的畸胎瘤是在移植部位发生的，原因是移植过程中将未分化或低分化的iPS细胞引入体内。所以，为避免畸胎瘤发生，重点要把握好植入机体内的细胞分化能力，以及要将移植细胞中所含未分化或低分化的iPS细胞的数量控制在不能形成畸胎瘤的范围内。利用慢病毒体外感染的方法，建立稳定表达Fluc和ZsGreen双报告基因的iPS细胞系，有助于我们在后续研究中利用小动物活体成像技术明确iPS细胞成瘤的最小剂量，对于长期动态观察iPS细胞在体内的分布具有重要意义。

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Generation of an induced pluripotent stem cell line harboring Fluc and ZsGreen dual reporter genes

FAN Quan-rong1, SHI Jun-wen1, JIA Jun-shuang1, GAO Fei1, ZHANG Yu-qin1, ZHAO Zun-lan1, YAO Kaitai1, XIAO Dong1,2(1. Cancer Research Institute, Southern Medical University, Guangzhou Guangdong 510515, China; 2. Institue of Comparative Medicine and Center of Experimental Animals, Southern Medical University, Guangzhou Guangdong 510515, China)

XIAO Dong E-mail: Xiao_d@hotmail.com

Background and purpose：Induced pluripotent stem cells (iPS cells) have demonstrated a good prospect, which includes repairing damaged tissues, organs and the treatment of human diseases, but iPS cells have the ability to form a teratoma, which is one of the huge obstacles involved in its security used in clinical trials. Thus, this study intended to establish mouse iPS cell lines carrying firefly luciferase (Fluc) and green fluorescent protein (ZsGreen) dual reporter genes to lay the foundation for in vivo monitoring teratoma formation and determining the minimum cell dose required for teratoma formation. Methods：To generate lentiviral expression vector harboring Fluc and zsGreen genes, Fluc gene was amplified by PCR from the template of pLH2BmRFP, and subsequently cloned into the plasmid of pHAGE-fullEF1a-MCS-IzsGreen to obtain the final vector of pEF1a-Fluc-IRES-ZsGreen (referred to as pELZG) which was used to produce lentiviruses carrying Fluc and ZsGreen genes, followed by confirming that lentiviruses harboringFluc and ZsGreen genes were successfully made through GFP assay under fluorescent stereo microscope after infecting 293T cells. Lentivirus supernatant harboring Fluc and ZsGreen genes were employed to infect iPS cells, followed by GFP assay under fluorescent stereo microscope several days after infection. The labeled iPS cells were transplanted into subcutaneous of nude mice. Results：As expected, the gel electrophoresis of pELZG vector respectively digested with XbaⅠ, PvuⅡ and SacⅠ, respectively resulted in a 10.005 kb, 3.282 kb, 6.723 kb, and 2.441 kb, 3.401 kb, 6.604 kb bands. It indicated that the lentiviral vector carrying the Fluc and ZsGreen dual reporter gene was successfully constructed. Mouse iPS cells were successfully infected by lentivirus supernatant, while the complete GFP-positive iPS cell colonies were obtained by picking clones. After iPS cells were transplanted into nude mice, teratoma formation was observed. Conclusion：Mouse iPS cell line stably expressing Fluc and ZsGreen genes was successfully generated, and the Fluc- and ZsGreen-labeled iPS cells can trace the formation and development of the teratoma.

Firefly luciferase; Green fluorescent protein; Lentivirus; 293T cells: Induced pluripotent stem cells; Teratoma

R730.269

：A

：1007-3639(2013)01-0010-07

2012-09-21

2012-11-02）

国家自然科学基金项目(No：81172587)；广东省自然科学基金项目(No：9151063101000015)；广东省科技计划项目(No：2009B060300008)。

肖东 E-mail:Xiao_d@hotmail.com

DOI: 10.3969/j.issn.1007-3969.2013.01.002