徐 飞，王晓中，龚波林*

1宁夏回族自治区疾病预防控制中心，宁夏750004;2宁夏大学能源化工重点实验室，宁夏750021

宁夏枸杞(Lycium barbarumL．)为茄科(Solanaceae)枸杞属(Lycium)植物，在我国川北、华北北部、内蒙古、陕西、甘肃、宁夏、青海和新疆等地均有分布。宁夏枸杞(Lycii Fructus)又名枸杞子，是宁夏枸杞的干燥果实，其味甘、性平，归肝、肾经，具有滋肾调肺，补肝明目的功效。现代药理学研究证实，宁夏枸杞具有抗癌，抗衰老，抗肿瘤，降低血脂和血糖等多方面的药理作用［1，2］。我们在对宁夏枸杞醇提物正丁醇部位活性成分的研究中，分离得到另外1个香豆素类化合物，经理化性质和波谱学数据分析鉴定了它的结构为法荜枝苷(fabiatrin)，为宁夏枸杞中首次分离得到。现代药理学研究表明，香豆素类化合物具有多种生物学活性，具有抗HIV、抗癌、抗炎、抗凝血、保护心血管系统等作用［3，4］。前文我们曾报道过，采用HPLC法测定了宁夏枸杞中东莨菪素(scopoletin)和东莨菪苷(scopolin)的含量［5］。本文我们建立了HPLC测定不同地区宁夏枸杞中法荜枝苷含量的方法，为宁夏枸杞制定新的标准及品质评价提供依据。

1 材料与仪器

1．1 仪器和试药

AM-400核磁共振谱仪(瑞士布鲁克公司);LTQ-XL二维线性离子阱质谱仪(美国热电公司);TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司);Diamonsil C8柱(150 mm × 4．6 mm，5 μm)(迪马公司);BS224S电子天平(德国赛多利斯公司);甲醇、乙腈为色谱纯(天津市大茂化学试剂公司);醋酸为色谱纯(天津市光复精细化工研究所);其他试剂均为国产分析纯;水为纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

本实验所用的原料购自宁夏药材公司，依次编号为L1-宁夏枸杞Ⅰ号，L2-宁夏枸杞Ⅱ号，L3-宁夏农科院Ⅰ号，L4-宁夏农科院Ⅱ号，L5-宁夏南梁农场，L6-甘肃兰州，L7-内蒙古沙海，L8-新疆精河。经宁夏医科大学牛阳教授鉴定为宁夏枸杞(Lycium barbarumL．)的果实宁夏枸杞(Lycii Fructus)，凭证标本现存于宁夏天然产物工程中心。材料取回后，60℃真空干燥，粉碎后，粗粉过60～80目筛后，密封备用。

1．2 对照品的制备

法荜枝苷的对照品为实验室自制，系从宁夏枸杞70%醇提物正丁醇部位中分离得到，并经MS和NMR等现代谱学技术鉴定其结构;按照本方法的色谱条件归一化法测得它们的纯度为98．5%。理化性质及谱学数据如下:

化合物:淡黄色粉末(CH3OH)，mp．239 ～240℃。香草醛-浓硫酸反应显红色，254 nm和365 nm紫外灯下具强烈蓝色荧光，提示可能为香豆素类化合物。ESI-MS，m/z:487．1［M+H］+;1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:7．82(1H，d，J=8．0 Hz，H-4)，7．23(1H，s，H-5)，7．12(1H，s，H-8)，6．24(1H，d，J=8．0 Hz，H-3)，4．94(1H，d，J=7．2 Hz)，4．24(1H，d，J=8．0 Hz)，3．10 ～ 5．0 为糖上其他氢原子信号;13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:169．3(C-2)，114．7(C-3)，145．7(C-4)，110．8(C-5)，148．3(C-6)，151．7(C-7)，103．2(C-8)，150．8(C-9)，114．6(C-10)，57．1(6-OCH3)，102．1(glc-1')，73．60(glc-2')，76．9(glc-3')，70．6(glc-4')，75．0(glc-5')，69．5(glc-6');105．5(xyl-1")，73．3(xyl-2")，77．3(xyl-3")，69．5(xyl-4")，66．0(xyl-5")。以上数据与文献报道［6］的法荜枝苷(fabiatrin)基本一致。结构见图1。

图1 法荜枝苷的结构Fig.1 Chemical structure of fabiatrin

2 方法与结果

2．1 溶液制备

2．2．1 对照品溶液的制备

精密称取法荜枝苷2．0 mg置于100 mL容量瓶中加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

2．1．2 供试品溶液的制备

精密称取干燥的宁夏枸杞粉末2．5 g，60℃甲醇回流提取3次，液料比=1∶20，回流时间依次为2 h、1．5 h、1 h。过滤后，用少量甲醇多次洗涤滤渣，合并浓缩提取液，转入并定容于100 mL容量瓶中，用0．45μm的有机滤膜过滤，即得供试品溶液。

2．2 色谱条件

Diamonsil C8柱(150 mm × 4．6 mm，5 μm);流动相为 A:乙腈-水-醋酸(5∶94．5∶0．5)，B:乙腈-水-醋酸(72∶27．5∶0．5)，梯度范围:0 ～18 min，100%-90%A，18 ～35 min，90% ～70%A，35-45 min，70%-0%A;柱温:30℃;检测波长:346 nm;流速:1 mL/min。法荜枝苷对照品及供试品的HPLC图见图2。

图2 法荜枝苷(1)的对照品(A)及供试品(B)的色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of fabiatrin(1)reference substance(A)，and sample extract(B)

2．3 线性关系考察

精密移取法荜枝苷的对照品溶液适量，以甲醇定容于10 mL容量瓶中，配制成浓度分别为0．1、0.2、0．5、1．0、2．0、2．5、5．0、10 μg/mL 的溶液。分别取上述溶液各20μL，平行进样3次，取平均值。以质量浓度(X，μg/mL)为横座标，峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线并进行回归计算，得法荜枝苷回归方程为Y=18961X+417．58(r=0．9998，n=8)。表明法荜枝苷在0．1～10μg/mL范围内线性良好。

2．4 检测限试验

逐级稀释(2．1．1)项下的样品溶液，按照(2．2)项中所述色谱条件进样，当信噪比为3∶1时法荜枝苷的检测限为0．15μg/mL。

2．5 精密度试验

分别配制低、中、高3个质量浓度的法荜枝苷对照品溶液，按照(2．2)项中所述色谱条件进样，1 d内重复测定5次，考察日内精密度;连续测定5 d，考察日间精密度。试验结果见表1。

表1 精密度试验结果(n=5)Table 1 Intra-day and inter-day precision test of fabiatrin(n=5)

2．6 重复性试验

取干燥的宁夏枸杞粉末6份，按(2．1．2)项所述的方法操作，制得6份溶液，每次进样20μL，测定峰面积，计算样品中法荜枝苷含量的平均值(n=6)为44．2 μg/g;RSD 为1．97%。

2．7 稳定性试验

供试品溶液在0～12 h内每隔2 h进样20 μL，测定峰面积，计算样品中法荜枝苷峰面积的RSD为1．76%。结果表明在12 h内供试品溶液稳定。

2．8 加样回收率试验

取已知含量(其中法荜枝苷43．3μg/g)的干燥的宁夏枸杞粉末6份，每份1．0 g，分别向其中加入适量的法荜枝苷对照品，按(2．1．2)项所述的方法操作，制得6份供试品溶液，每次进样20μL，测定峰面积，计算样品中法荜枝苷的平均回收率。试验结果见表2。

表2 法荜枝苷的加样回收率试验结果Table 2 The results of recovery test of fabiatrin

2．9 样品测定结果

分别精密吸取法荜枝苷对照品溶液和供试品溶液各20μL，平行进样3次，记录色谱图，按外标法以峰面积计算样品中法荜枝苷的含量。试验结果见表3。

表3 不同地区宁夏枸杞中法荜枝苷的含量(n=3)Table 3 Concentrations of fabiatrin detected in Lycii Fructus from different regions(n=3)

L3 2012-08-14 38．7 1．77 L4 2012-08-14 39．8 1．43 L5 2012-08-15 37．5 1．86 L6 2011-08-10 34．2 1．65 L7 2012-08-07 26．1 2．01 L8 2012-08-16 30．5 2．10

3 讨论

3．1 提取条件的优化

本文考察了不同溶剂对提取的影响，比较了乙醇、甲醇和80%甲醇。结果以甲醇提取效率最佳，乙醇的提取率最低。通过不同固液比的提取率的比较，发现m(宁夏枸杞)∶V(甲醇)=1∶20的溶剂量较为合适。3次回流时间分别选择2、1．5、1 h的依据是首次提取需要浸润的时间长，而后含量相对减少，所以后2次提取时间依次递减。

3．2 流动相的选择

分别考察了不同比例甲醇-水和乙腈-水的流动相，发现流动相为乙腈-水能获得较好的分离效果，但是存在拖尾现象，在考察加入不同缓冲盐及酸后发现在流动相中加入0．5%的醋酸以后效果最好，峰形得到明显改善。

3．3 最大吸收波长的选择

根据紫外光谱图显示法荜枝苷的最大吸收波长在346 nm，故选定346 nm为测定波长。

3．4 小结

结合文献［5］，我们在对宁夏枸杞化学成分的研究过程中发现，宁夏枸杞中的香豆素类化合物主要是东莨菪素及其苷类，即1号色谱峰为法荜枝苷(fabiatrin)、2号色谱峰为东莨菪苷(scopolin)和3号色谱峰为东莨菪素(scopoletin)。通过HPLC法测定其含量表明，不同地区宁夏枸杞中这3个香豆素的含量存在差异，其中法荜枝苷的含量从26．1～43．3 μg/mL间不等。

本方法可以准确、快捷的测定宁夏枸杞中法荜枝苷的含量。本文所建立的方法，重复性及回收率好，结果可靠。

1 Xing SR(邢世瑞)．Ningxia ZhongYaoZhi(Second edition)Vol I．Ningxia:Ningxia People's Publishing House(宁夏人民出版社)，2006．51-67．

2 Potterat O．Goji(Lycium barbarumandL．chinense):phytochemistry，pharmacology and safety in the perspective of traditional uses and recent popularity．Planta Med，2010，76:7-19．

3 Kong LL(孔令雷)，Hu JF(胡金凤)，Chen NH(陈乃宏)．Advances in pharmacology and toxicology of coumarins．Chin Pharm Bull(中国药理学通报)，2012，28:165-168．

4 Kim EK，Kwon KB，Shin BC，et al．Scopoletin induces apoptosis in human promyeloleukemic cells，accompanied by activations of nuclear factor kappaB and caspase-3．Life Sci，2005，77:824-836．

5 Xu F(徐飞)，Wang XZ(王晓中)，Zhang L(张雷)，et al．Determination of scopoletin and scopolin inLycium barbarumby HPLC．Chin JExp Trad Med Form(中国实验方剂学杂志)，2012，18:67-70．

6 Zhu HY(朱华勇)，Wu J(吴娟)，Huang S(黄帅)，et al．Study on the chemical constituents extracted fromPrzewalskia tangutica．West China JPharm Sci(华西药学杂志)，2011，26:305-307．