李秀芳，代 蓉，李国花，2，雷 娜，林 青*

1云南中医学院药理教研室，昆明650200;2云南省大理白族自治州人民医院，大理671000

对羟基苯甲醛是兰科植物天麻(Gastrodia elataBlume．)的主要化学成分之一，课题组前期的研究表明，天麻乙酸乙酯提取物具有较强的抗血小板聚集活性［1］，将天麻乙酸乙酯提取物进行硅胶柱色谱分离，得到一组酯溶性酚性成分，对该组成分进行抗血小板聚集活性筛选后初步确定，对羟基苯甲醛为主要的活性成分，本文对对羟基苯甲醛的体外、体内抗血小板聚集活性进行了研究，并对其经口给药的急性毒性进行了考察。

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．1．1 药物与试剂

对羟基苯甲醛，上海百灵威科技有限公司，批号:LB20K01，纯 度 99%;ADP(Sigma，批 号:A2754);AA(Sigma，批号:A9673);PAF(Sigma，批号:D00080940);阿司匹林，山东新华制药有限股份公司，批号:09795;吐温-80(化学纯CP)，国药集团化学试剂有限公司，批号:F20090324;水合氯醛(分析纯)，天津市瑞金特化学品有限公司，批号:20090814;枸橼酸钠，天津市化学试剂三厂，批号:091107。

1．1．2 动物

昆明种小鼠，清洁级，雌雄各半，体重18～22 g，批号:Dossy-2011-03;健康家兔，雌雄各半，体重2～2．5 kg，生产批号:Dossy-2009-10;雄性(Sprague Dawley，SD)大鼠，清洁级，体重 250 ～300 g，生产批号:Dossy-2011-01，所有动物均由四川省医学科学研究院动物研究所提供，饲养条件:室温为22±2℃，相对湿度60%～70%。

1．1．3 仪器

LBY-NJ2血液凝聚仪:北京普利生仪器有限公司;赛多利斯XS125A分析天平:北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1．2 实验方法

1．2．1 对羟基苯甲醛对ADP、AA和PAF诱导的家兔体外血小板聚集的影响

36只家兔随机分为6组，即溶媒对照组(1%吐温-80)、对羟基苯甲醛5个浓度组。用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉家兔，自颈总动脉取血，收集于一次性塑料试管中，采用3．2%枸橼酸钠抗凝，血液与抗凝剂容积比为9∶1，取血后立即颠倒混匀，血液于室温分别采用200×g离心6min，得富血小板板血浆(platelet rich plasma，PRP)，剩余血液再以1000×g离心15 min，得贫血小板血浆(platelet poor plasma，PPP)，按 Born 氏比浊法［2］，分别以 ADP、AA、PAF为诱导剂，采用血小板聚集仪测定5 min内血小板最大聚集率。血小板聚集抑制率按下式计算:聚集抑制率(%)=(1-给药组聚集率/对照组聚集率)×100%。

1．2．2 对羟基苯甲醛抗ADP诱导的家兔体外血小板聚集作用的重现性考察

动物分组、取血、测定方法同1．2．1。血小板聚集诱导剂为ADP。

1．2．3 对羟基苯甲醛对ADP引起的小鼠急性肺栓塞的保护作用

方法［3］，取健康昆明种小鼠100只，雌雄各半，随机分为5组，即溶媒组(1%吐温-80)、模型组、阳性对照组(阿司匹林)、对羟基苯甲醛低剂量组、对羟基苯甲醛高剂量组，每组动物20只。以上各组动物(除阳性对照组外)均按分组灌胃给予相应剂量的受试药物，每日一次，连续给药3 d，于末次给药后1 h，分别尾静脉注射ADP生理盐水液390 mg/kg，阳性对照组经尾静脉一次注射给予阿司匹林后1 h，尾静脉注射ADP生理盐水液390 mg/kg，观察30 min内动物死亡数。

1．2．4 对羟基苯甲醛对大鼠下腔静脉血栓形成的影响

参考文献方法［4］，取清洁级雄性SD大鼠，随机分为4组，即模型组、阳性对照组(阿司匹林)、对羟基苯甲醛低剂量组、对羟基苯甲醛高剂量组，每组8～9只。大鼠连续给予相应受试药物7 d，模型组给予溶媒(1%吐温-80)，末次给药后30 min，大鼠以3%戊巴比妥钠麻醉，腹部正中切口打开腹腔，分离下腔静脉，用细丝线结扎，缝合腹腔，结扎4 h后，处死大鼠，打开腹腔，在结扎下方2 cm处用动脉夹夹闭下腔静脉管腔，将结扎段血管剪下，剖开血管，轻轻取出血栓，放于滤纸上，吸干血液，用微量电子天平称取血栓湿重。

1．2．5 对羟基苯甲醛经口给药的急性毒性

经预试验测得小鼠90%死亡率的致死量为1.80 g/kg体重，最小致死量为0．85 g/kg体重，在这两个剂量之间，按1∶0．9的比例设置7个剂量组。正式试验，取合格昆明种小鼠70只，雌雄各半，按体重随机分7组，每组10只。试验前禁食不禁水12小时，7 个给药组小鼠分别按 1．80、1．62、1．46、1.31、1．18、1．06、0．96 g/kg，于 24 h 内一次灌胃给予对羟基苯甲醛溶液，给药体积均为0．4 mL/10 g体重。密切观察12 h。以后上、下午各观察一次，连续观察14 d，每天观察各组小鼠的外观、行为和毒性反应，并记录各组小鼠的死亡数，采用Bliss法计算小鼠的半数致死量。

1．3 统计方法

采用SPSS13．0软件进行统计，计量资料方差齐者采用t检验，方差不齐者采用t’检验;率的比较采用χ2检验。

2 结果与讨论

2．1 结果

2．1．1 对羟基苯甲醛抗ADP、AA和PAF诱导的家兔体外血小板聚集的作用

结果显示，对羟基苯甲醛能够显著对抗ADP诱导的家兔体外血小板聚集，其作用强度呈明显的浓度依赖性特点，对AA诱导的血小板聚集仅高浓度时有效，而对PAF诱导的血小板聚集作用不明显，提示，对羟基苯甲醛对ADP、AA、PAF三种途径的血小板聚集具有选择性的对抗作用，以对抗ADP途径的血小板聚集作用最强，详见表1。

表1 对羟基苯甲醛抗ADP、AA、PAF诱导的家兔体外血小板聚集作用± s，n=6)Table 1 Effect of4-HBAL on platelet aggregation induced by ADP，AA and PAF± s，n=6)

表1 对羟基苯甲醛抗ADP、AA、PAF诱导的家兔体外血小板聚集作用± s，n=6)Table 1 Effect of4-HBAL on platelet aggregation induced by ADP，AA and PAF± s，n=6)

注:给药组与溶媒组相比，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01。Note:Medicine group vs vehicle control group*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01．

聚集率(%)ADP AA PAF溶媒组Vehicle control group 1%吐温组别Group药物终浓度Final drug concentration(mg/mL)－80 46．60 ±4．64 56．27 ±3．54 53．55 ±4．91对羟基苯甲醛 4 －HBAL 0．4 8．47 ±4．10＊＊ 49．70 ±4．84* 48．25 ±3．69 0．2 31．92 ±4．71＊＊ 51．12 ±4．75 50．47 ±2．85 0．1 38．57 ±5．13* 52．58 ±3．73 51．37 ±2．74 0．05 40．03 ±3．83* 53．18 ±3．88 51．45 ±4．36 0．025 44．28 ±2．17 54．67 ±3．75 53．20 ±1．90

2．1．2 对羟基苯甲醛抗ADP诱导的家兔体外血小板聚集作用的重现性

结果显示，对羟基苯甲醛能显著性对抗ADP诱导的家兔体外血小板聚集，实验结果重现性较好，经计算，其体外抗血小板聚集的IC50为2 mmol/L，详见表2。

表2 对羟基苯甲醛抗ADP诱导的家兔体外血小板聚集作用重现性± s，n=6)Table 2 Reproducibility of effect on platelet aggregation induced by ADP of 4-HBAL± s，n=6)

表2 对羟基苯甲醛抗ADP诱导的家兔体外血小板聚集作用重现性± s，n=6)Table 2 Reproducibility of effect on platelet aggregation induced by ADP of 4-HBAL± s，n=6)

注:给药组与溶媒组相比，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01。Note:Medicine group vs vehicle control group，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01．

组别Group药物终浓度Final drug concentration(mg/mL)ADP聚集率Aggregation rate(%)抑制率Inhibition rate(%)IC50溶媒组Vehicle control group 1%吐温 －80 46．57 ±2．77 － 2 mmol/L对羟基苯甲醛 4 －HBAL 0．4 9．17 ±1．38＊＊ 80．31 0．2 32．50 ±2．05＊＊ 30．21 0．1 39．90 ±1．61* 14．32 0．05 41．92 ±1．70* 9．98 0．025 43．13 ±1．73 7．39

2．1．3 对羟基苯甲醛抗ADP引起的小鼠急性肺栓塞的作用

结果显示，对羟基苯甲醛低剂能降低动物的死亡率，而高剂量组与模型组相比差异无统计学意义作用不明显，详见表3。

表3 对羟基苯甲醛抗ADP引起小鼠急性肺栓塞的作用(n=18～20)Table 3 Effect on mice pulmonary embolism induced by ADP of4-HBAL(n=18-20)

2．1．4 对羟基苯甲醛抗大鼠静脉血栓形成的作用

结果显示，对羟基苯甲醛高、低剂量均能显著减轻血栓湿重，对抗大鼠静脉血栓形成。详见表4。

表4 对羟基苯甲醛抗大鼠静脉血栓形成的作用±s)Table 4 Effect on thrombosis of rat inferior vena cava of4-HBAL±s)

注:给药组与模型组比较，*P ＜ 0．05，＊＊P ＜ 0．01。Note:Medicine group vsmodel group，*P ＜ 0．05，＊＊ P ＜ 0．01．

组别Group剂量Dose(mg/kg)动物数Number of animals血栓湿重Wetweight of thrombus(mg)-80 9 27．58 ±13．58阳性对照组 Positive control group 20 8 4．10 ±3．47＊＊对羟基苯甲醛高剂量组4-HBAL high dose group 20 9 3．73±2．96＊＊对羟基苯甲醛低剂量组4-HBAL low dose group 10 8 6．78±4．28模型组Model group 1%吐温＊＊

2．1．5 对羟基苯甲醛经口给药的急性毒性

结果显示，小鼠灌胃给予对羟基苯甲醛后，中毒表现主要为身体及四肢颤抖，呼吸急促，俯卧不能走动直至死亡，死亡时间集中在给药后2 h内，死亡动物大体解剖，肉眼观察主要脏器，可见胃肠道充血。采用Bliss法计算小鼠的半数致死量，小鼠灌胃给予对羟基苯甲醛的 LD50为1．23 g/kg体重，LD50的95%可信限为 1．03 ～1．40 g/kg，详见表5。

表5 小鼠经口给予对羟基苯甲醛的LD50Table 5 LD50 of 4-HBAL given through themouth

2．2 讨论

血栓性疾病是一类严重危害人类健康和生命的疾病，其发病率、致残率和致死率都很高，临床上常见的血栓性疾病包括急性冠脉综合征、急性缺血性脑血管病、糖尿病患者的血栓形成、血栓闭塞性脉管炎、急性肿瘤引起的血栓等。血小板的活化、聚集在血栓形成和发展过程中起着重要的作用，因此抗血小板聚集药物也是上述血栓性疾病治疗中的有效药物之一。

对羟基苯甲醛是天麻的主要成分之一，也是一种重要的有机化工中间体，它的发现与合成已有近百年的历史，在医药工业中，常用于多类药物及中间体的合成，如抗生素阿莫西林的合成、袪痰药杜鹃素的中间体对羟基肉桂酸的生产等［5］。课题组前期的研究提示，对羟基苯甲醛可能是天麻乙酸乙酯提取物中抗血小板聚集的主要活性成分之一，然而迄今为止，尚未见关于对羟基苯甲醛抗血小板聚集活性的报道。本研究结果显示，对羟基苯甲醛在体内、体外均有抗血小板聚集活性，且其作用具有选择性对抗ADP途径的血小板聚集的特点;在对抗大鼠下腔静脉血栓形成方面，同等剂量(20 mg/kg)情况下，对羟基苯甲醛的作用强度与阳性对照药阿司匹林相当。

本研究结果提示，对羟基苯甲醛可能可以作为活性成分用于抗血栓性疾病药物的开发，但需要注意的是，对羟基苯甲醛小鼠经口给药具有一定的急性毒性，毒性表现以胃肠道刺激为主。

参考文献

1 Yu ZP(淤泽溥)，Lin Q(林青)，Li XF(李秀芳)，et al．Effect and mechanism of ethyl acetate extract from Gastrodia elata Blume．on platelet aggregation induced by ADP．Chin Tradit Herbal Drugs(中草药)，2007，38:743-745．

2 Born GV．Aggregation of blood platelet by diphosphate and its reversal．Nature，1962，194:927-929．

3 Li SQ(李圣青)，Zhang J(张艰)，Qi HW，et al．Establishment and comparison of different pulmonary embolism models in mice，Acad J Fourth Mil Med Univ(第四军医大学学报)，2004，25:1379-1382．

4 Chen Q(陈奇)．Methodology of pharmacological study of Chinese herbalmedicine(中药药理研究方法学)，Beijing:People’s Medical Publishing House，1993:510-511．

5 Li C(李超)，Wang GY(王桂英)，Yao RS(姚日生)．The application＆synthetical technology of p-hydroxybenzaldehyde．Anhui Chem Industry(安徽化工)，2008，34(3):17-19．