白 雁，李小庆，雷敬卫

河南中医学院，郑州450046

白芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall的干燥根，为我国临床常用传统中药，有养血柔肝、缓中止痛、敛阴收汗的功能［1］，芍药苷(paeoniflorin，PF)是白芍的主要有效成分之一［2］。《中国药典》2010版已对白芍的质量控制做出明确的规定，在含量测定项中以芍药苷为指标，利用高效液相色谱法对其进行含量测定，但该法需对药材进行分离提取，耗时耗试剂，不适合中药的快速检测。近红外分析技术是一种二次分析技术，其光谱信息来源于有机物中含氢基团 X-H(X=C、O、N、S、P)振动的倍频和合频吸收，因此其谱带宽，组分之间谱带重叠现象严重，不能用于直接分析，而是综合多学科(光谱学、化学计量学和计算机等)知识的现代分析技术，具有快速、无损、可同时进行多项测定等优点。因此，本研究尝试用近红外建立芍药苷含量测定的新方法，对白芍中芍药苷进行快速分析，以满足中药现代化的需求。

1 仪器与材料

美国Thermo Nicolet 6700型傅立叶变换近红外光谱仪(漫反射积分球附件、OMNIC光谱采集软件和TQ8．0分析软件);Waters2695高效液相色谱仪(PDA2998紫外检测器);METTLER TOLEDO AL204万分之一分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);HS-6150型超声波清洗器(500W，40 kHz，昆山市超声仪器有限公司);FW-200型高速药材粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司);CS101-2D电热鼓风干燥箱(上海实验仪器厂有限公司);乙腈、甲醇为色谱纯，水为市售纯净水。芍药苷对照品(批号:1107036-201035，供含量测定用)由河南省药检所提供;106份白芍样品由河南省宛西制药股份有限公司提供。

2 实验方法

2．1 近红外光谱数据的采集

将106份白芍样品粉碎过65目药典筛，每份样品取约8 g，混合均匀后放人石英样品杯中，摊平，然后以空气为参比，扣除背景，采集光谱图。采样方式:积分球漫反射;采集光谱范围:4000 cm-1～12000 cm-1;分辨率:8 cm-1;扫描次数:32次;温度:(25±2)℃;相对湿度:45% ～50%。每份样品扫描3次，求平均值作为样品的NIR光谱。

2．2 芍药苷含量的HPLC测定

参照2010版《中国药典》中白芍项下芍药苷含量测定中HPLC进行测定。色谱柱为Diamonsil C18(200 mm × 4．6 mm，5 μm)，以乙腈-0．1% 磷酸溶液(14∶86)为流动相，检测波长230 nm，柱温25℃，流速1．0 mL/min，进样体积10μL，以保留时间定性，峰面积定量，外标法计算。每份样品平行做2次，以其平均值作为HPLC分析值。

2．3 芍药苷定量分析模型的建立

依据芍药苷的含量分布，从106份白芍样品中选择20个作为验证集，其余作为校正集，将验证集和校正集的NIR光谱与HPLC分析值相关联，输入到TQ8．0软件中，选择不同的光谱预处理方法，建模谱段以及主因字数建立定量校正模型，所建模型用相关系数(R2)和内部交叉验证均方差(RMSECV)来评价，R2越接近于1，RMSECV越小，表明模型结构越合理，其预测能力可通过预测均方差(RMSEP)来衡量，RMSEP越小，表明模型的预测性能和推广能力越强［3］。

3 结果与讨论

3．1 白芍样品NIR图谱的采集

106份白芍样品的近红外光谱叠加图见图1。

3．2 白芍样品的芍药苷含量测定

图1 106份白芍样品的近红外光谱叠加图Fig.1 NIRS spectra of106 Paeoniae Radix Alba samples

按2．3项下的方法对106份白芍样品中芍药苷含量进行了测定，其含量范围为1．32% ～3．49%，并以此值作为建立近红外模型的真实值。

3．3 白芍中芍药苷定量校正模型的建立

3．3．1 校正集和验证集的选择

运用TQ8．0定量分析软件中PLS法建立模型。根据白芍样品中芍药苷含量分布情况，从106份白芍样品中选择86个样品作为校正集，20个样品作为验证集。为使校正集样品更具代表性，验证集样品的芍药苷含量应在校正集含量范围之内［4］，见表1。

表1 校正集与验证集中芍药苷含量分布Table 1 Concentration distribution of paeoniflorin of calibration set and validation set

3．3．2 光谱预处理方法、光谱范围及主因子数的选择

在建立模型前，首先对样品的原始吸收光谱进行预处理。本实验进行的是粉末样品的NIR漫反射采集，由于样品颗粒尺寸、均匀性等的影响，光程无法保持恒定，不利于建模时有效信息的提取，因此本实验用标准正则变换(SNV)和多元散射校正(MSC)来对光谱进行处理，以消除这些因素的干扰。导数处理是净化图谱、消除光谱偏移或漂移的常用方法，可根据需要进行一阶导数(First Derivative)和二阶导数(Second Derivative)处理。但导数处理在消除基线偏移的同时，也放大和分离了重叠的信息，放大了噪声信号，因此，在对光谱进行微分处理时，需对光谱进行平滑处理，常用的平滑的处理方法有Savitzky-Golay滤波和Norris Derivative滤波。预处理方法对R2、RMSECV及RMSEP的影响如表2所示，由表2知最优预处理方法为MSC+First De- rivative+SG。

表2 不同预处理方法对校正模型影响Table 2 Calibration results with different preprocessingmethods

手动优选最佳波段，辅以R2、RMSECV及RMSEP作为模型性能的评价指标。通过比较，确定4014．56 ～ 7503．91 cm-1为最佳波段，如表3所示。

表3 不同建模区间对模型性能的影响Table 3 The effect of different spectral regions onmodel performance

图2 主因子数对模型RMSECV的影响Fig.2 The RMSECV value with differentmain factors

本文采用交互验证法考察主因子数对RMSECV的影响(图2)，当RMSECV最小时，所选主因子数最佳［5］，由图2知最佳主因子数为11，此时 RMSECV=0．33068。

3．3．3 白芍中芍药苷定量模型的建立

采用以上确定的最优条件，即106份白芍样品的近红外光谱经过MSC+FirstDerivative+SG处理后，在 4014．56 ～ 7503．91 cm-1波段范围内，选择前11个主成分建立最优校正模型，NIR预测值与参考值相关图见图3，偏差图见图4。由图知，该模型R2=0．99395，RMSECV 及 RMSEP 分别为 0．33068、0.0756，可以看出NIR预测值与参考值非常接近。

Vol.25 白 雁等:近红外光谱法快速测定白芍中芍药苷含量36 1

图3 芍药苷的NIRS预测值与真实值的相关图Fig.3 Correlation between NIR predicted value and actual value

图4 NIR预测值与真实值偏差图Fig.4 Deviation between NIR predicted value and actual value

3．4 芍药苷定量模型的内部验证

将20份验证集样品的NIR图谱输入定量分析模型，预测其芍药苷含量，并与其HPLC测得值进行比较，结果见表4。

表4 NIR预测值与HPLC测定值的比较Table 4 Comparison of NIR predicted value and actual value

由表4知，最大绝对偏差0．17%，以验证集样品的NIR预测值与HPLC测定值的比值作为预测回收率，所得平均回收率100．07%，结果表明，利用近红外光谱技术测定白芍药材中芍药苷的含量是可行的。

3．5 统计学检验

将20份验证集样品的NIR预测值与HPLC测得值进行配对t检验，结果，t=-1．44，双侧P=0.887 ＞0．05，按 α =0．05 水准不拒绝H0，差异无统计学意义，即2种方法的分析结果差异无统计学意义，该模型可以准确预测其覆盖范围内的白芍药材中芍药苷含量。

3．6 讨论

NIR定量模型的反复优化过程中，性能指数(Performance Index，PI)即相对残差和是确定最优模型的一个重要参数，最大值是100，越接近100表明所建模型精度越好。在3．2项预处理方法选择中，预处理方法为MSC+ First Derivative时R2=0.99425为最高，预处理方法为MSC+First Derivative+SG时RMSECV和RMSEP为最低，无法确定最优模型。而预处理方法为MSC+First Derivative时模型的PI为86．9低于预处理方法为MSC+First Derivative+SG时的87．3，因此，确定最优的光谱预处理方法为MSC+First Derivative+SG。

本实验将NIRS与PLS相结合，建立了白芍中芍药苷定量校正模型，该模型的R2=0．99395，RMSECV 及 RMSEC 分别为0．33068、0．0563，预测均方差(RMSEP)和平均回收率分别为 0．0756和100.07%。表明该模型准确、可靠，可以准确预测其覆盖范围内的白芍药材中芍药苷含量。但该模型建模所用样本均由一个厂家提供，样品来源略显单一，因此，需要不断增加样品集数量，对模型进行再校正和优化，提高模型的适用性和稳健性，更好的应用于实际当中，以满足中药现代化的需求。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission(国家药典委员会)．Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(中华人民共和国药典)．Beijing:China Medical Science Press，2010，Vol I．97．

2 Sun LR(孙丽荣)，Cao X(曹雄)，Hou FQ(侯凤青)，et al．Progressive studies of paeoniflorin．China J Chin Mat Med(中国中药杂志)，2008，33:2028-2032．

3 Bai Y(白雁)，Li S(李姗)，Wang X(王星)，et al．Determination of chlorogenic acid of honeysuckle by near-infrared spectroscopy rapidly．Chin J Exp Tradit Med Form(中国实验方剂学杂志)，2011，17(5):66-69．

4 Zhang SN(章顺楠)，Yang HL(杨海雷)，Liu ZQ(刘占强)，et al．On-line monitoring the contents of active components in the solution for Fufangdanshen dripping pills by near-infrared spectroscopy．JPharm Anal(药物分析杂志)，2009，29:192．

5 Lu WZ(陆婉珍)．Modern Near Infrared Spectroscopy Analytical Technology(现代近红外光谱分析技术)．Beijing:China Petreochemical Press，2007．44．