朱婷伟，陈复生，布冠好，孙 倩，刘昆仑

(河南工业大学粮油食品学院，河南郑州450001)

大豆是我国种植面积最广、食用最多而又廉价的植物蛋白资源，在食品工业中广泛使用［1］。但同时大豆是8类主要致敏食物之一。大豆蛋白是存在于大豆种子中许多蛋白质的总称，成分按沉降系数不同分为2S组分8%～22%、7S组分35%、11S组分31%～52%、15S组分5%及存在的少量其他成分。其中，7S组分中约85%是β－伴大豆球蛋白;11S组分中约85%是大豆球蛋白［2］。大豆球蛋白和β－伴大豆球蛋白是大豆中蛋白质的主要构成成分，二者约占到70%。大豆过敏可引发过敏体质人群产生Ⅰ型过敏反应，目前在线过敏原数据库中收录有41条大豆过敏原信息［3］。多项研究证实，大豆蛋白过敏原会引起婴幼儿、仔猪、犊牛、大鼠等幼龄动物的过敏反应［4］。约1%～6%的婴幼儿对大豆过敏，随着对大豆及大豆产品使用量的增加，成年人对大豆过敏的发生率也在日趋上升［5］。大豆过敏可引起胃肠道紊乱，皮炎性过敏，恶心、呕吐，严重时还可导致休克和死亡［6］。近些年，有学者就主要过敏原的抗原表位，过敏原改性方法及检测方法进行了一定研究，但对大豆过敏原的抗原表位、结构特性及过敏原的种类等研究还不够完善。本文将对大豆蛋白主要过敏原的相关研究进展进行总结，为大豆蛋白过敏原结构、抗原表位的完善及低敏性大豆蛋白制品的开发提供重要的理论依据。

1 大豆蛋白过敏原的结构与功能

大豆抗原是大豆中的主要抗营养因子之一，是能引起过敏反应的一类蛋白质，亦称大豆过敏原。Franck［7］研究发现，不同的大豆产品中蛋白质含量和抗原分布不同。大豆中发现有致敏性的蛋白如表1所示。其中7S球蛋白组分中的Gly m Bd 28K和Gly m Bd 30K和β－伴大豆球蛋白的α亚基Gly m Bd 60K是大豆中的主要致敏原［8］。

1.1 Gly m Bd 30K

Gly m Bd 30K与P34的氨基酸组成和N端氨基酸序列一致，故又名P34。它是由257个氨基酸残基组成的不溶于水的单分子糖蛋白，分子量约为34ku，等电点为5.79［15］。该蛋白能与β－伴大豆球蛋白的亚基通过二硫键结合来参与大豆蛋白的折叠。单晓红［15］等对Gly m Bd 30K二级结构预测的结果显示:α－螺旋占 29.29%，β－转角占 5.28%，β－折叠占19.53%，无规则卷曲为45.91%。除部分α－螺旋和β－转角在蛋白质的外侧，绝大部分β－折叠在蛋白质的中间区域。P34与木瓜蛋白酶家族的三级构象是一致的，属于木瓜蛋白酶超家族。图1为预测的P34的三级结构示意图［15］。

30K主要存在于种子的子叶里，能与油体结合在一起。P34可能是植物对抗假单胞菌的一种防御蛋白，其生物学功能通过结合细菌分泌的丁香交酯而起防御的作用;有研究显示P34的变种大豆还可作为调节丁香交酯分泌的信号感受器［16］。

1.2 Gly m Bd 60K

β－伴大豆球蛋白包含α亚基、α'亚基和β亚基三个亚基，分子质量分别约为68、71和50ku，它们以同源或异源的三聚体形式存在［17］。其中Gly m Bd 60K是由多糖与蛋白质N端的天门冬氨酸结合而成，等电点为4.9。袁德保［18］等利用远紫外圆二色光谱对纯化得到的β－伴大豆球蛋白二级结构进行了表征，其中α亚基的二级结构中，α－螺旋占9.8%，β－折叠占32.1%，β－转角占22.8%，无规则卷曲占35.4%。其模拟的三级结构示意图如图2所示［19］。

表1 大豆中抗原蛋白及其相关性质［9］Table 1 Allergen proteins in soybean and their relative characteristics［9］

图1 预测的P34三级结构示意图Fig.1 Predicted tertiary structure of P34

图2 Gly m Bd 60K的三维结构示意图Fig.2 Three－dimensional structure of Gly m Bd 60K

60K具有较好的热稳定性［20］。左伟勇提到有人从α亚基中提取到的soymetide－4能够刺激人的多核白细胞的吞噬作用，且在动物实验中能够抑制服用抗癌药所引起的秃毛症;更有研究表明伴大豆球蛋白能刺激肝脏中的低密度脂蛋白受体，降低胆固醇的含量［21］。

1.3 Gly m Bd 28K

Gly m Bd 28K是一种类蚕豆球蛋白，属于Cupin超家族。它是大豆7S组分中的另一种重要的过敏原，包含了220个氨基酸残基，分子质量约为26ku，等电点为6.1［22］。28K的多糖分支链为β－1→2木糖和α－1→3岩藻糖，在植物体内以寡聚体形式存在，推测的糖骨架为Man3GIcNAc［23］2，结构为普通的β－桶形。28K的前体为C－末端的23ku肽，N266残基的羧基侧裂解发生28K与前体的转换，且在28K中内切酶可能与天冬氨酰肽链内切酶功能类似，参与到植物蛋白的代谢过程中［24］。

2 大豆蛋白的过敏原表位

引起人过敏的过敏原大多数是食物中的蛋白质，实质上，与过敏反应相关的是蛋白质中部分抗原决定簇，又称为表位［25］。Burks［26］的免疫印迹实验发现大豆过敏患者的血清中存在对7S球蛋白有特异性的IgE抗体和对11S有特异性的IgG抗体。Ogawa等［9］利用人体血清中IgE抗体与致敏原相结合的特性，通过检测69位过敏患者血清检索出大豆蛋白质多种成分的抗原性，发现Gly m Bd 30K、Gly m Bd 28K和Gly m Bd 60K是大豆中的三种主要致敏原。之后，有人对这3种主要的大豆过敏原结合表位等相关信息做了报道。

2.1 Gly m Bd 30K

Ogawa研究发现［8］Gly m Bd 30K 能被65%的大豆敏感个体血清所识别产生过敏症状，被认为是致敏性最强的储藏蛋白。在1996年Bando［27］对30K的糖基化位点进行了研究，通过测定其氨基酸序列确定了抗体结合部位。30K的氨基酸顺序如图3所示［15］。经氨基酸序列分析糖蛋白的结合位点位于多肽链170位天冬酞胺处。其多糖部分包括甘露糖，N－乙酞氨基葡萄糖，岩藻糖，木糖四种糖分子，其比例为 3∶2∶1∶1［23］。Hosoyama［28］等发现 30K 的 2 个重要抗原表位区F5和H6。抗原表位分析成熟的30K蛋白至少有14个抗原表位，在30K的70位和170位的氨基酸存在两个潜在的糖基化位点。P34的活性部位中的第38位半胱氨酸上拥有一个甘氨酸取代基，缺乏其家族中其他蛋白酶的半胱氨酸酶活性接触位点。紧接着Helm等［29］研究发现了30K蛋白上其中5个主要的抗原表位分别被定于3～12、100～110、229～238、299～308 和 331～340 位的氨基酸残基上，且不同的IgE抗原表位结合能力的差异显著性因不同过敏病人血清而异。林苏霞［30］等成功构建的Gly m Bd 30k蛋白的抗原表位区单体为制备用于大豆主要过敏原检测的试剂奠定了基础。

图3 Gly m Bd 30K氨基酸顺序示意图Fig.3 Amino acid sequence schematic of Gly m Bd 30K

2.2 Gly m Bd 60K

60K的mRNA带有poly(A)尾，且在N－端含有一个22个氨基酸的信号肽，去除信号肽后的前体肽为583个氨基酸，而成熟的60K由543个氨基酸形成［31］。Gly m Bd 60K 的氨基酸顺序如图 4 所示［32］。其IgE抗原表位位于不含糖基化位点的N－端232－383 残基处［31］。Ogawa［14］等研究只证明了 α 亚基能被25%的大豆过敏患者的血清所识别，是β－伴大豆球蛋白组分中的一个过敏原。直到2009年，Krishnan［33］等研究发现 Gly m Bd 60K 能与大豆敏感个体血清中IgE特异性结合而引起大豆过敏症状。

2.3 Gly m Bd 28K

Tsuji等［22］以单克隆抗体作为配体，用免疫亲和柱层析法分离纯化大豆主要过敏原中Gly m Bd 28K。28K的糖基化位点可能是IgE抗体识别的重要的表位，由473个氨基酸的多肽组成。Dolly［34］研究表明28K的N－末端与NBS－LRR型抗病花生蛋白有同源性，12个残基序列为GRREDDYDNLQL;推导出的氨基酸序列与MP27/MP32具有高度的同源性，与南瓜蛋白中的存储空泡蛋白有50.4%的同一性，与胡萝卜蛋白之间有45.9%的同一性。Gly m Bd28K的致敏性为N－连接糖部分，并与大多过敏患者血清中的IgE抗体结合，其氨基酸顺序如图5所示［24］。有研究［35］发现在距28K多肽分子C端23ku处一个非常重要的IgE结合区域，这对大豆过敏原的研究具有重要意义。Hiemori等［36］发现，大豆过敏患者血清中IgE抗体识别位点为肽骨架第20位天冬酞胺连接的N－连接聚糖，此过敏原能引起约25%的大豆敏感个体产生过敏症。Xiang［34］等研究发现，该过敏原肽链C端区域结合IgE的能力比N端区域更强，其抗原表位主要的线性C－末端抗原表面位于S256和A270之间，并定位了 Y260，D261，D262，K264 和 D266 这5个主要IgE结合的氨基酸残基。

图5 Gly m Bd 28K氨基酸顺序示意图Fig.5 Amino acid sequence schematic of Gly m Bd 28K

3 结论

随着对Gly m Bd 28K、Gly m Bd 30K和Gly m Bd 60K三大主要大豆过敏原的普遍认可，以及近年来食物过敏的严重性和发生频率的不断上升，食品过敏问题必须重视。30、60、28K是目前发现的三种主要大豆蛋白过敏原，这些过敏原分子上分布着很多过敏原表位，IgE结合实验也证实了许多表位的存在。已有应用于大豆过敏原检测的方法的研究，但还没有形成灵敏度高、快速且成本低的检测方法，且关于这三种过敏原结构功能、抗原表位区域及致敏机理等的研究还不够成熟，而这些相关生化特性的探究是建立大豆过敏原检测及降低的重要理论依据。文章中仅总结了部分过敏原功能及表位的研究。更多的相关研究以及大豆蛋白中存在的其他过敏原也尚需探究。为了精确定位大豆主要过敏原表位，今后需进一步研究构成表位的必需氨基酸残基、大豆抗原蛋白的完整组成，深入了解复杂的过敏反应，揭示重要抗原蛋白的致敏机理，同时优化和改进大豆抗原检测方法同样具有潜在的需要。这些将为大豆蛋白过敏原掩蔽方法、改性大豆蛋白、开发低敏性大豆蛋白制品提供重要的理论依据。

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