唐 艳，桂 余，任文瑾，彭 林，刘 雄

(西南大学食品科学学院，重庆北碚400715)

薜荔(Ficus pumila L.)属桑科榕属植物，亦称木莲、木馒头、凉粉树等，常绿攀缘或匍匐灌木，主要分布在我国中部和南部，如云南、广西、湖南、四川、湖北等地［1－2］。薛荔籽果胶附着于籽表皮层，是水溶性、粘性和胶凝性都很好的一种非淀粉多糖类的膳食纤维。在人类营养学中，作为人体每日必需的“第七大营养素”，膳食纤维是健康饮食中不可缺少的元素，在消化生理等方面的作用已被证实，它的摄入量与动脉硬化、冠心病、肠憩室疾病的发生有关，适当的摄入量还能预防和减少结肠瘤、便秘、痔疮及上述疾病的发生［3－4］。大量动物实验证实，果胶在肠道代谢、改善血糖和血脂水平等方面有一定的健康作用，可有效地降低肝和血中胆固醇及甘油三酯浓度［5－6］，并能降低一些慢性病(如糖尿病、大肠癌、肥胖等)的发病率［7］。大量研究表明，肠道健康的改善与增加短链脂肪酸SCFA产量、降低肠道pH、降低肠道中氨和苯酚浓度、降低肠道中次级胆汁酸分泌、粪水中细胞毒素的量、减少排空时间和改善细菌活性等方面相关［8］。果胶作为肠道益生因子，能够促进肠道中乳酸菌、双歧杆菌等有益菌的生长，提高有益菌比例，并产生丰富的SCFA(short－chain fatty acids)改善肠道pH，促进肠细胞生长，抑制结肠癌等［9－10］。本研究室已有研究结果表明薛荔籽果胶可以缓解辣椒素引起的肠道环境恶化(研究结果另文发表)。目前，果胶的提取方法可分为5种:水提取法、酸提取法、微波萃取法、酶法和离子交换树脂提取法。唐翠娥［11］比较了水提薛荔籽果胶和酸提薛荔籽果胶的理化性质，结果显示水提薛荔籽果胶色浅、纯度高、分子量大、灰分低等优点。说明简单的水提薛荔籽果胶能极大的保留其天然活性成分，并降低成本。医学研究结果表明，妇女进入更年期后，由于卵巢机能衰退或丧失，雌激素分泌逐渐减少，容易出现以植物神经功能紊乱代谢障碍为主的一系列症候群，如肠道疾病、冠心病、动脉硬化等［12］。肠道作为人体的最大微生态环境，肠道健康直接关系到人的生活质量与寿命周期。现有的传统药物对于肠道疾病的治疗方法，疗效多不明显，故有必要进一步寻找疗效更好、副作用更少的新药。故本研究以水提薛荔籽果胶为原料，以去势雌性大鼠为对象建立动物模型，测定肠道相关指标来探讨水提薛荔籽果胶对大鼠肠道健康的影响，旨在为拓展薛荔籽果胶的综合开发利用程度和新的保健食品的开发，提供新的实验依据和数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

体重90～110g健康雌性SD大鼠 重庆滕鑫比尔实验动物销售有限公司;薛荔籽果胶 实验室自制，薛荔籽购于云南大市场;柑橘果胶 河南兴源化工厂品有限公司;食用级95%的无水乙醇、L－胱氨酸、D－半乳糖醛酸、咔唑、苯酚、亚硝基铁氰化钠、冰乙酸、氯化胆碱、NaClO、NaCl、NH4Cl、NaOH 均为分析纯;盐酸、硫酸 优级纯;巴豆酸、乙酸、丙酸、丁酸

均为色谱纯;厌氧菌培养基、BS培养基、LBS培养基、EMB培养基、PSE培养基 青岛海博生物技术有限公司;玉米淀粉 西安国维淀粉有限责任公司;酪蛋白 食品级，华羚集团公司。

GC－2012气相色谱仪 日本岛津公司;DHG－9070电热恒温干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司;JA2003Ax型电子天平 上海精天电子仪器有限公司;Spectrumlab－22可见分光光度计 上海棱光技术有限公司;ES－315 高压蒸汽灭菌锅;5810型台式离心机 德国Eppendorf公司;WH－1 微型漩涡混合仪;SW－CJ－1FD 超净工作台;HH－B11 电热恒温培养箱;BC－J160S二氧化碳培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.2 动物与环境

动物饲养实验室符合国标清洁级，笼具干净、安全。室内照明控制在12h/12h光暗周期节律。室内平均气温24～26℃，相对湿度40%～60%。

1.3 动物饲料

自制基础饲料配方(1000g):玉米淀粉479.5g、酪蛋白200g、大豆油100g、蔗糖100g、矿物质105g、混合维生素10g、L－胱氨酸3g、氯化胆碱2.5g。

薛荔籽果胶组和柑橘果胶组饲料分别用150g薛荔籽果胶和柑橘果胶替代基础饲料中的150g玉米淀粉。

1.4 实验方法

1.4.1 原料的提取和果胶纯度的测定 果胶提取工艺流程［11］:干薛荔籽→低温浸提30min→滤布过滤→95%乙醇沉淀，静置24h→78%乙醇洗涤→真空干燥→粉碎→果胶成品。

采用咔唑硫酸法，依据果胶的水解产物半乳糖醛酸在强酸溶液中与咔唑发生紫色显色反应，526nm处测反应液的吸光度，试样中半乳糖醛酸含量与所对应的吸光度成正比，样品中的果胶物质总量即为半乳糖醛酸含量。

标准曲线绘制:称取0.01g D－半乳糖醛酸标品，用蒸馏水定容于100mL容量瓶中，制成100mg/L的标准溶液。准确吸取标准液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，于6支25mL具塞刻度试管中，用蒸馏水稀释至 1mL，摇匀，即得一组浓度为 0、20、40、60、80、100mg/L的半乳糖醛酸标准液。分别加入浓硫酸6.0mL，沸水浴中加热30min后冷却至室温，各加入0.2mL 1.5mg/mL咔唑无水乙醇溶液，摇匀，在室温下暗处放置30min后于526nm处测各反应液的吸光度。以测得的吸光度为纵坐标，每升标准液中半乳糖醛酸含量为横坐标，制作标准曲线。

分别称取0.01g薛荔籽果胶和商品柑橘果胶，蒸馏水定容至100mL容量瓶中，准确吸取1mL果胶溶液于25mL具塞比色管中参照以上步骤测其吸光度，对应的吸光度带入标准曲线中即可得出半乳糖醛酸含量。

1.4.2 动物实验

1.4.2.1 建立更年期综合症大鼠模型 将体重为90～110g的健康雌性SD大鼠32只，单笼饲养于不锈钢大鼠笼中，实验前大鼠用基础饲料适应性喂养1周，自由采食、饮水，无不良反应、进食、饮水和活动正常者方可纳入实验中。适应一周后，按体重随机分出8只进行伪切除(Sham)手术作为对照组，其余3组大鼠则进行双侧卵巢切除(OVX)手术。整个手术过程中，已向大鼠腹部注射戊巴比妥钠(30mg/kg)进行麻醉。手术后继续用自制基础饲料饲养一周进行恢复，再进入实验饲料阶段。

表1 薛荔籽果胶对去势大鼠采食习惯、体重及其粪便量的影响Table 1 Effects of Ficus Pumila L.Seeds Pectin on diet habit，body weight and fecal bulk in ovariectomized rats

1.4.2.2 分组与饲养 恢复一周后，将OVX组的大鼠随机分为OVX－CN组、15%FPLP组、15%CP组。实验饲料期间，每天称进食量，每隔三天称一次体重，以记录大鼠饮食、生长规律。喂养四周后处死大鼠，连续收集处死大鼠的前四天粪便，真空冷冻干燥后称重，－20℃冰箱冷冻保存待用。收集盲肠内容物，－80℃冷冻保存待用，测定每组大鼠盲肠内容物和盲肠壁重、游离氨、SCFA、微生物数量。

1.5 统计分析

实验数据进行相应的数据转换后再利用SPSS软件进行统计分析，实验结果以¯x±s表示，显著性水平设为p＜0.05和p＜0.01。

1.6 检测指标与方法

1.6.1 盲肠内容物SCFA测定 根据参考文献采用气相色谱法并略作修改［13］，测定指标为乙酸、丙酸、丁酸。

1.6.2 水分测定 105℃恒温干燥至恒重。

1.6.3 粪便、盲肠内容物及盲肠壁重 称重法，精确到小数点后三位，

1.6.4 盲肠壁表面积测定 生理盐水洗净盲肠壁，吸水纸吸干水分，展开并固定在具有标准刻度线(cm)的白色塑料板上，相机拍摄并打印下来，剪下纸上的盲肠轮廓图，测出照片上的每单位厘米刻度线的面积(L2，cm2)，电子天平称量轮廓图纸重量(W1，g)和平方厘米的纸重量(W2，g)，精确到小数点后三位，然后按以下公式计算出盲肠表面积［14］:

1.6.5 盲肠内容物游离氨的测定 称取0.2g左右盲肠内容物，加入2mL无氨水，充分混匀后在4000r/min的转速下离心5min，取1mL上清液，依次加入1mL含有0.001mol/L亚硝基铁氰化钠的0.5mol/L苯酚溶液和1mL含有0.03mol/L次氯酸钠的0.625mol/L氢氧化钠溶液，60℃保温5min使反应完全，再在625nm波长下测吸光度［13］。

1.6.6 盲肠内容物中微生物的测定 取盲肠内容物0.2g，加入1.8mL无菌生理盐水，依次10倍稀释至10－7。通过预实验，每种微生物选择3个适宜稀释度，各以0.2mL接种到相应的培养基上进行培养。测定对象为乳酸杆菌、双歧杆菌、厌氧菌、大肠杆菌、肠球菌。双歧杆菌和乳酸杆菌分别选用BS琼脂培养基和和LBS琼脂培养基，37℃下二氧化碳细胞培养箱中厌氧培养72h计数。厌氧菌采用厌氧菌琼脂培养基，大肠杆菌培养选用EMB琼脂培养基，肠球菌选用PSE琼脂(胆汁七叶苷叠氮钠琼脂)培养基，37℃下恒温培养箱中培养48h计数。以log cfu/g统计微生物数量。

2 结果与讨论

2.1 果胶纯度

果胶纯度以D－半乳糖醛酸的含量计算，D－半乳糖醛酸的标准曲线见图1。

分别称取的0.01g薛荔籽果胶和商品柑橘果胶，按果胶纯度的具体测定步骤得到薛荔籽果胶和商品柑橘果胶的吸光度分为0.447和0.420，对应的D－半乳糖醛酸含量为分别为95.68%和89.95%，即薛荔籽果胶和商品柑橘果胶的纯度。

图1 D－半乳糖醛酸的标准曲线图Fig.1 Standard curve of content D－(+)－galacturonic acid

2.2 水提薛荔籽果胶对去势雌性大鼠肠道健康的研究结果

2.2.1 薛荔籽果胶对去势大鼠采食习惯、体重及其粪便量的影响 由表1可知，实验期间各组大鼠每日食物摄取量无显著性差异，但实验结束时OVX空白组的体重增长量、粪便干重显著高于Sham组(p＜0.01);在OVX组中，FPLP组和CP组大鼠体重增长量、粪便干重显著高于OVX空白组(p＜0.01)，其中，CP组大鼠体重增长量、粪便干重也显著高于FPLP组(p＜0.01)。本研究提示本身在单胃动物胃内不被消化吸收的果胶经肠道发酵后，促进了果胶组大鼠体重的增长。

2.2.2 薛荔籽果胶对去势大鼠盲肠重量、盲肠壁表面积及盲肠内容物含水率的影响 由表2可知，与Sham组相比，OVX空白组盲肠总重、肠壁湿重和内容物重及盲肠壁表面积、盲肠内容物含水量都有增加趋势，其中盲肠内容物达到显著差别(p＜0.05);在OVX组中，FPLP和CP组盲肠总重、肠壁湿重和内容物重及盲肠壁表面积、盲肠内容物含水量与OVX空白组相比都极显著增加(p＜0.01)，同时CP组盲肠壁湿重高于FPLP组(p＜0.01)。本研究提示盲肠内容物重量的增加除了卵巢切除造成的内分泌紊乱等内在因素外，还与加有果胶的外在膳食因素所引起的肠道发酵以及盲肠内容物含水量的大量增加密切相关，并且后者是主要因素。盲肠壁重和盲肠面积的增加直接与果胶的发酵产物SCFA的浓度增加相关。

表2 薛荔籽果胶对去势大鼠盲肠重量、盲肠壁表面积及盲肠内容物含水率的影响Table 2 Effects of Ficus Pumila L.Seeds Pectin on cecum weight，area of cecum tissue and cecum water(%)in ovariectomized rats

表3 薛荔籽果胶对去势大鼠盲肠酵解产物的影响(μmol/g湿重)Table 3 Effects of Ficus Pumila L.Seeds Pectin on SCFA products in cecum in ovariectomized rats(μmol/g wet contents)

表4 薛荔籽果胶对去势大鼠盲肠酵解产物的影响Table 4 Effects of Ficus Pumila L.Seeds Pectin on cecum contents FA in ovariectomized rats

2.2.3 薛荔籽果胶对去势大鼠盲肠酵解产物的影响 由表3可知，OVX空白组与Sham组相比，盲肠内乙酸、丙酸和丁酸浓度无显著性差异，但有明显的降低趋势。在OVX组中，FPLP组乙酸、丙酸以及丁酸浓度均明显高于OVX空白组(p＜0.05);CP组乙酸、丙酸浓度显著高于OVX空白组(p＜0.05)，但丁酸与OVX空白组没有差别。SCFA对机体健康的重要性已有很多报道［15－19］，如调节肠道菌群，维持体液和电解质的平衡，给宿主提供能量，给肠道上皮细胞提供营养等。其中，丁酸的作用最为突出，它不仅提供上皮细胞营养，还对细胞的生长和分化具有保护作用，近年来受到极大关注［20］。本研究提示果胶组相比OVX空白组都不同程度的增加了盲肠中乙酸、丙酸、丁酸浓度，且FPLP组在增加丁酸含量上更有优势。

2.2.4 薛荔籽果胶对去势鼠盲肠内容物中游离氨的影响 由表4可知，相对与OVX空白组，Sham组明显降低了大鼠盲肠内容物中FA浓度(p＜0.05)。在OVX组中，与OVX空白组相比，FPLP和CP组盲肠内容物中FA浓度都有大幅降低(p＜0.05)，与Sham组大鼠水平相近。大鼠体内游离氨主要来自进入盲肠的未消化的含氮化合物，正常情况下，这部分物质将作为肠道细菌发酵氮源，但当细菌消耗量不足，则会向氨等低分子含氮化合物的转化［21］。本研究提示果胶经肠道发酵后，促进微生物利用氮资源，从而氨的释放、吸收减少。

2.2.5 薛荔籽果胶对OVX大鼠盲肠内容物中微生物的影响 由表5可知，Sham组各微生物的数量相比OVX空白组没有显著差别，但有益菌有增加趋势，有害菌有降低趋势，Sham组乳酸杆菌/大肠杆菌、乳酸杆菌/肠球菌的比例与OVX空白组相比显著升高(p＜0.05)，双歧杆菌/肠球菌的比例也极显著高于OVX空白组(p＜0.01)。在OVX组中，与OVX空白组相比，FPLP组和CP组双歧杆菌、乳酸杆菌、厌氧菌的数量显著升高，其中CP组乳酸杆菌、厌氧菌的数量达到极显著差别(p＜0.01)，CP组大肠杆菌和肠球菌的数量均显著高于OVX空白组(p＜0.05)，FPLP组大肠杆菌和肠球菌的数量与OVX空白组没有显著差别;与此同时，FPLP和CP组有益菌与有害菌的比例相比OVX空白组均有升高的趋势，其中，FPLP组乳酸杆菌/大肠杆菌的比例达到显著差别(p＜0.05)，双歧杆菌/肠球菌、乳酸杆菌/肠球菌的比例达到极显著差别(p＜0.01)，CP组双歧杆菌/肠球菌达到极显著差别(p＜0.01)。Madsen等［22］通过补加乳酸菌可防止因敲除白介素－10(IL－10)基因引起的大肠炎疾病的发生。Cani等［23］发现双歧杆菌的引入可有效抑制高脂小鼠血糖的升高，控制胰岛素正常分泌，从而避免了糖尿病的发生。本研究提示果胶经肠道发酵后，促进了肠道微生物的生长繁殖，需氧活菌数(如大肠杆菌、肠球菌)增加，兼性厌氧活菌数(如双歧杆菌、乳酸菌)和厌氧菌也增多，并且兼性厌氧活菌上升更迅速，有益菌与有害菌的比例升高。

表5 薛荔籽果胶对OVX大鼠盲肠内容物中微生物的影响Table 5 Effects of Ficus Pumila L.Seeds Pectin on cecum contents microbe in ovariectomized rats

3 结论

本研究的主要目的是探讨薛荔籽果胶对更年期妇女肠道健康的影响，研究结果表明OVX成年雌鼠由于卵巢切除造成雌性激素缺乏，使得有利于肠道健康的SCFA的浓度、双歧杆菌、乳酸杆菌以及有益菌与有害菌的比例都明显降低，并且由于肠道菌群失调产生了更多的游离氨，同时体重增加这一外在表现与更年期妇女症状相似。而通过饲料中添加果胶则对上述影响肠道健康的症状有明显的改善作用。大量研究表明用果胶喂食大鼠一段时间后，发现大鼠各个肠段的长度、肠壁重、肠细胞数、SCFA浓度明显增加，肠道内总厌氧菌属、拟杆菌属、梭菌属、肠菌属的细菌数量都较多［24－26］，与本实验结果相一致。薛荔籽果胶能明显升高盲肠内容物SCFA的浓度，同时降低游离氨浓度，促进肠道有益菌生长，从而改善肠道内环境，说明薛荔籽果胶有益于去势雌性大鼠肠道健康。另外，实验发现果胶组大鼠体重较OVX空白组明显增加，这一现象与以往食用果胶的研究结果不一致［27－28］，大鼠体重增加与肠道发酵的关系还有待进一步的研究。综上所述，本研究肯定了薛荔籽果胶对更年期妇女肠道健康的改善作用，对其合理食用薛荔籽果胶具有一定的指导意义。

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