侯传伟，王安建，李顺峰，沈 琪，2，魏书信

(1.河南省农科院农副产品加工研究所，河南郑州450002;2.河南农业大学食品科学技术学院，河南郑州450002)

多糖具有多种生物活性，可提高免疫力、降血糖、抗肿瘤、抗病毒等，由于其功能独特，并且毒性较低，因此在抗衰老、抗病毒和肿瘤、糖尿病治疗等方面有良好的应用前景［1］。同时多糖还可以改善食品的食用品质、加工特性和外观特性，可用于抑制脂质氧化［2］，稳定酸性饮料［3］，作为乳化剂［4］等，在食品中的用途十分广泛。双孢菇(Agaricus Bisporus)属伞菌目蘑菇科蘑菇属大型真菌，具有较高的营养价值和药用价值，享有“素中之王”的美称，是我国目前出口量最大、创汇最高的一种食用真菌［5－7］。双孢菇不仅是一种味道鲜美，营养齐全的菇类蔬菜，而且是具有保健作用的健康食品，含有多种有效药物成分，其中多糖是重要成分之一［8］。然而，在双孢菇收获和加工过程中大量的菇柄作为废弃物被丢弃，既污染环境又造成了资源的浪费。因此，从双孢菇废弃物菇柄中提取有效功能成分，不仅可以减少对环境的污染，还可以提高菇农和蘑菇生产加工企业的经济效益，对双孢菇废弃物菇柄进行合理的开发和利用具有重要的现实意义。本实验采用单因素和正交实验法［9－10］对水提醇沉法［11］提取双孢菇菇柄多糖的条件进行优化研究，以确定最佳的提取工艺，为双孢菇废弃物菇柄多糖产品的开发提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

双孢菇菇柄 采自河南省驻马店西平县食用菌培养基地;葡萄糖(105℃干燥至恒重)、98%浓硫酸、重蒸苯酚、无水乙醇等 均为国产分析纯;实验用水 均为蒸馏水。

GZX－9140MBE型数显鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;万能粉碎机 上海金刚电器厂;精密电子天平 常州万泰天平仪器有限公司;HZ－B水浴恒温振荡器 上海博远实业有限公司医疗设备厂;H2050R型高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;UV－2802型紫外可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 多糖含量测定 采用硫酸－苯酚法测定多糖含量［12－13］。分别精确吸取浓度为100mg/L的葡萄糖标准溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 置于 25mL 比色管中，加水至2.0mL，再分别加入5%重蒸苯酚溶液1.0mL和浓硫酸5.0mL，摇匀放置10min后，置于20～30℃水浴中保温15min。然后在490nm波长处测定吸光值，以葡萄糖含量(mg/mL)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线(图1)，回归方程为y=7.8389x+0.0034(R2=0.9997)。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

1.2.2 双孢菇菇柄多糖提取方法 本实验采取水提醇沉的方法提取双孢菇菇柄中的多糖，提取方法［14］如下:双孢菇菇柄40℃烘干后粉碎过60目筛，准确称取干粉2.00g，加适量水，在一定温度下水浴一段时间后4000r/min离心10min，上清液定容至50mL。取定容后上清液10mL，加入适量乙醇，混匀，置4℃冰箱中醇析沉淀多糖1h，4000r/min离心10min，弃上清液，所得沉淀用水溶解后定容至50mL。吸取上述溶液0.5mL，按1.2.1步骤测定多糖含量。每组实验重复3次，取其平均值。依据标准曲线，计算多糖得率。

多糖得率(%)=多糖量/双孢菇菇柄量×100

1.2.3 双孢菇菇柄多糖提取正交实验设计 依据单因素实验结果，采用L9(34)正交实验设计对双孢菇菇柄多糖提取进行优化。正交实验因素与水平设计见表1。

表1 正交因素水平Table 1 Factor levels of orthogonal test

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 浸提温度对多糖得率的影响 在液固比15∶1的条件下，控制浸提温度为 50、60、70、80、90℃的恒温水浴中提取60min，提取一次，测定结果如图2。随着浸提温度的升高，多糖得率也增加，故选90℃较好。有研究报道，温度升高可增加多糖的扩散系数和溶解性，有利于多糖从材料介质中进入提取溶剂内，从而可提高多糖的得率［15－16］。

图2 浸提温度对双孢菇菇柄多糖得率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharides from Agaricus bisporus waste stipe

2.1.2 液固比对多糖得率的影响 按液固比5∶1、10∶1、15∶1、20 ∶1、25 ∶1，在 90℃ 恒温水浴中浸提60min，提取一次，测定结果如图3。由图可知:随着液固比的增加，多糖得率也逐渐增加，但在液固比达到15∶1时再增加水溶液的比例，其多糖得率的增加不明显，液固比为 25∶1时仅比 15∶1时增加了0.14%，考虑后续工作和节约溶剂用量等综合因素，故选择液固比15∶1为宜。张民等［17］报道水体积的增加有利于多糖物质的运输，从而可以提高多糖的提取率，但超过一定比例后影响并不显著。

图3 液固比对双孢菇菇柄多糖得率的影响Fig.3 Effect of ratio of liquid to solid on the yield of polysaccharides from Agaricus bisporus waste stipe

2.1.3 浸提时间对多糖得率的影响 在液固比15∶1，浸提温度为90℃的恒温水浴中分别浸提30、60、90、120、150、180min，提取一次，测定结果如图 4 所示。由图4可以看出，在浸提时间为30～60min时，多糖得率由3.50%增加到4.00%，继续延长浸提时间，多糖得率不再增加反而下降，故选较优浸提时间为60min。

2.1.4 提取次数对多糖得率的影响 在液固比15∶1，浸提时间60min，浸提温度为90℃的恒温水浴中分别浸提1、2、3次，测定结果如表2。由表2可知，随着提取次数的增加，多糖得率逐渐增加，但提取3次与提取2次结果相差不多，综合考虑产率、能耗等因素，选择提取2次为好。

图4 提取时间对双孢菇菇柄多糖得率的影响Fig.4 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides from Agaricus bisporus waste stipe

表2 提取次数对双孢菇菇柄多糖得率的影响Table 2 Effect of extraction times on the yield of polysaccharides from Agaricus bisporus waste stipe

2.1.5 乙醇用量对多糖得率的影响 按液固比15∶1，在90℃恒温水浴中浸提60min的条件下，分别加入1、2、3、4倍量的无水乙醇，置冰箱醇析 1h。测定结果如图5，在实验范围内，随乙醇用量的增加多糖得率随之增加，乙醇用量达2倍体积后多糖得率增加不显著，故选2倍乙醇用量沉淀多糖较合适。

图5 乙醇用量对双孢菇菇柄多糖得率的影响Fig.5 Effect of volume of ethanol to extract for precipitation on the yield of polysaccharides from Agaricus bisporus waste stipe

2.1.6 醇沉时间对多糖得率的影响 按液固比15∶1，在90℃恒温水浴中浸提60min的条件下，加入2倍量的无水乙醇，分别置冰箱醇析 0.5、1、2、3、4h。测定结果如图6。由图可明显看出，醇析2h时多糖得率最高，而在醇沉时间为3h和4h时，多糖得率与醇析2h无显著差异，故选2h醇析为好。

2.2 正交实验结果

以多糖提取得率为指标，对双孢菇菇柄多糖的提取条件进行优化。正交实验结果及方差分析见表3、表4。

从表3中的极差R可看出，对多糖得率的影响依次为D＞B＞A＞C，即影响多糖提取的最主要因素是提取次数，其它依次为浸提时间，浸提温度，液固比。由表4可见，提取次数的F值达到显著水平(p＜0.05)，即提取次数对多糖得率的影响显著。由表3中的k值可以看出，用热水浸提多糖的最佳工艺组合为 A2B3C2D3，即浸提温度 85℃、浸提时间90min、液固比15∶1、提取3次，经测定多糖提取得率为5.50%。

图6 醇沉时间对双孢菇菇柄多糖得率的影响Fig.6 Effect of ethanol precipitation time on the yield of polysaccharides from Agaricus bisporus waste stipe

表3 正交实验设计及结果Table 3 Design and results of orthogonal test

表4 方差分析结果Table 4 Results of variance of analysis

3 结论

通过单因素实验和正交实验表明，在热水浸提双孢菇废弃物菇柄多糖的过程中，影响多糖得率的主要因素依次为提取次数、浸提时间、浸提温度、液固比。通过正交实验分析优化，在乙醇用量为2倍体积，醇析时间为2h时，最佳提取工艺参数为浸提温度85℃、浸提时间90min、液固比为15∶1、提取次数为3次，此时多糖得率可达5.50%。

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