朱素英

(菏泽学院生命科学系，山东菏泽274015)

植物多酚是一类以苯酚为基本骨架，苯环上含有多个羟基的次生代谢产物，在植物中含量丰富，包括简单多酚、单宁、黄酮类、原花青素等，研究表明，多酚类具有较强的清除自由基的能力和抗氧化活性，可使机体免受代谢过程中产生的自由基和过氧化物的损害［1］。芦笋(Asparagus officinalis)学名石刁柏，百合科天门冬属多年生宿根性草本植物，是一种药食两用植物，其嫩茎供食用，鲜嫩可口，营养丰富，有“蔬菜之王”美誉。同时芦笋还具有抗衰老、增强免疫力、降血脂、抗肿瘤等作用［2］。芦笋含有丰富的类黄酮物质(主要是芦丁)、多糖、类胡萝卜素等，其中类黄酮类物质属于多酚类［3］。目前对于芦笋黄酮类以及药理研究的比较多，但对于生理活性多样的多酚类物质的提取工艺方面的研究仍是空白。因此本实验以正交设计对芦笋多酚进行进行提取优化，以期为芦笋的进一步加工利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白芦笋嫩茎 于5月份采自菏泽沙土镇田间，真空干燥箱中干燥至恒重，称取200g，粉碎过40目筛，备用;Folin－Ciocalteau试剂 上海荔达有限公司;没食子酸(GA)、乙醇等 均为分析纯。

RE52AA型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;SHZ－D(Ⅲ)型循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司;HH－8数显恒温水浴锅 江苏省金坛市江南仪器厂;DZF－6050型真空干燥箱 上海博讯实业公司;DL－4型飞鸽台式离心机 上海安亭科学仪器厂;FW－100型高速万能粉碎机 北京市永光明医疗仪器厂;TU－1810型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 芦笋多酚的提取

1.2.1 标准曲线的绘制 精确称取没食子酸10mg，用乙醇溶解定容于100mL容量瓶中，配制成0.1mg/mL没食子酸标准溶液。分别取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准溶液于10mL容量瓶中。加入稀释10倍Folin－Ciocalteau 试剂 1mL，4mL 10% 的 Na2CO3溶液，定容至10mL。于40℃水浴反应40min后在波长765nm处测定其吸光度，绘制标准曲线［4］。平行测定3次。得回归曲线Y=8.123X+0.065，R2=0.9981;其中X为没食子酸的浓度(mg/mL)，Y为吸光度，线性关系良好。

1.2.2 芦笋多酚的提取工艺和含量测定 准确称取一定量的白芦笋粉，置于50mL锥形瓶中，按照各因素考察条件进行提取，过滤，定容，按照1.2.1，进行吸光度的测定，测得的吸光度代入回归方程进行计算各提取液的总多酚没食子酸当量浓度(mgGAE/mL)，以及多酚总质量，计算多酚得率［5］。

芦笋多酚得率(%)=［提取液浓度(mgGAE/mL)×提取液体积(mL)］/［白芦笋粉质量(g)×1000］×100

1.2.3 芦笋多酚提取工艺的优化 在单因素实验的基础上，选择对芦笋多酚含量影响较大的4个因素，设置误差空列，采用L16(54)设计进行正交实验，考察各因素对多酚提取量影响，实验设计如表1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 The levels and factors of orthogonal test

2 结果与分析

2.1 料液比对芦笋多酚提取的影响

精确称取芦笋细粉1g，按照固定条件80℃水浴温度，乙醇体积分数80%，提取时间60min。料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，进行提取，结果如图 1。

图1 不同料液比对芦笋多酚得率的影响Fig.1 Effect of solid－to－solvent ratio on the total phenolic extraction rate from Asparagus officinalis

从图1可以看出，随着料液比的增加，多酚得率逐渐增加，从1∶5～1∶15增加较快，从1.50%增加到6.35%，但在1∶15～1∶30范围内，多酚的提取率增幅不大，仅从6.35%增加到6.81%，说明多酚的饱和浓度在1∶15左右，溶剂少，多酚提取不完全，溶剂多，造成溶剂的浪费，所以对于芦笋多酚的提取适宜的料液比是1∶15左右。

2.2 提取温度对芦笋多酚提取的影响

准确称取1.0g的白芦笋粉末，以1∶15的料液比，提取时间60min，乙醇体积分数为80%，提取温度分别选择 20、40、60、80、100℃条件下提取，结果如图 2。

由图2可知，在芦笋多酚提取过程中，随着温度从20℃增长到80℃，提取的芦笋多酚得率逐渐增大，80℃达到6.24%，而到100℃又有所下降。这说明温度的增加有利于多酚物质的溶解度，但温度过高，会造成多酚物质的降解［6］，导致提取量降低。因此，为了保护多酚的生物学活性，以及节约经济的原则，多酚提取的适宜温度是80℃。

图2 不同提取温度对芦笋多酚得率的影响Fig.2 Effect of the different extraction temperature on the total phenolic extraction rate from Asparagus officinalis

2.3 提取时间对芦笋多酚的得率的影响

称取芦笋干燥粉末1.0g，提取温度80℃，料液比1∶15，乙醇体积分数为 80%，提取时间分别为 30、60、90、120、150min，考察提取时间对芦笋多酚得率的影响。

由图3可以看出，增大提取时间，多酚得得率也随着增加，90min时，提取率达到最大值，大于90min，提取率趋于稳定，并有所下降。这说明在一定提取时间范围内，提取时间越长，越有利于多酚物质的释放，但若提取时间超过这个范围，浸出的多酚物质，在溶液中被氧化，导致提取率降低［5］。

图3 不同提取温度对芦笋多酚得率的影响Fig.3 Effect of the different extraction time on the total phenolic extraction rate from Asparagus officinalis

2.4 乙醇浓度对芦笋多酚提取的影响

称取芦笋干燥粉末1.0g，提取温度80℃，料液比1∶15，乙醇浓度分别为20、40、60、80、100%，考察乙醇浓度对芦笋多酚得率的影响。

由图4可以看出，随着乙醇浓度的增加，总多酚的得率逐渐增加，60%时得率最大，随后逐渐降低。说明在乙醇浓度60%时，多酚的浸出最多。植物体内多酚常与蛋白质多糖等大分子通过氢键、疏水键等形成复合物，乙醇浓度过低时，水含量高，不能破坏多酚与大分子之间的键［7］，多酚提取的得率不高;研究表明，在中等极性溶剂中多酚类提取的得率较高［8］;乙醇浓度过高，会造成脂溶性成份浸出增加，影响多酚的提取，进而降低多酚的得率［9］。

图4 不同乙醇浓度对芦笋多酚得率的影响Fig.4 Effect of the different ethanol concentration on the total phenolic extraction rate from Asparagus officinalis

2.5 芦笋多酚提取工艺优化

在单因素的分析的基础上，选取乙醇浓度、提取时间、提取温度、料液比为实验因素，并设置误差空列项，采用5因素4水平L16(5)4进行正交设计实验，以优化芦笋多酚的提取工艺参数。结果如下，各因素对芦笋多酚影响大小依次为A＞B＞C＞D，极差分析显示，影响最大的因素为乙醇浓度，R值为5.09，其次是提取温度、提取时间，料液比影响最小。最佳因素组合为A2B4C2D3。

表2 正交实验设计及结果Table 2 Orthogonal array design and result for the four variables studied

2.6 实验各因素的显著性分析

对正交实验结果进行方差分析，从表3可以看出，各因素对芦笋多酚得率的影响次序为:A＞B＞C＞D，与极差分析结果一致，其中以乙醇浓度对多酚得率的影响最大，达到显著水平(p＜0.05)。

表3 正交实验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test results

2.7 对正交实验结果的验证

因最佳因素组合为A2B4C2D3不在正交表中，所以需要对最佳因素进行验证实验，即精确称取芦笋粉1.0g，三份，以1∶15的料液比加入50%的乙醇，80℃水浴条件下提取60min，得到芦笋多酚的得率为6.82%、6.95%、6.93%，平均得率为6.90%。RSD为1.01%，可以看出，该提取工艺比较稳定，可以达到优化的目的。

3 结论

通过单因素实验和正交实验，芦笋多酚提取优化的最佳因素条件为料液比1∶15，乙醇浓度50%，80℃水浴条件下提取60min，在此条件下，芦笋多酚的平均得率可达6.90%。本实验实验条件简单，可操作性强，可普及推广，通过本实验可以看出芦笋多酚含量较高，具有较高的营养价值，可为芦笋进一步加工利用奠定基础。

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［3］顾关云，蒋昱.芦笋的化学成分和生物活性［J］.国外医药:植物药分册，2007，22(2):47－50.

［4］陈红惠，吕静，彭郦，等.雪莲果叶中多酚的提取工艺研究［J］.食品科学，2009，30(2):88－91.

［5］张梅梅，郑维发，赵艳霞，等.正交实验法优化桦褐孔菌多酚类物质的提取工艺研究［J］.菌物学报，2010，29(5):760－766.

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