黎 婕，陈 中，林伟锋

(华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640)

柚子(pomelo)是柑橘属常绿果树，是典型的热带、亚热带水果，具有清爽、甘甜、营养丰富、风味独特等突出特点，并且柚子皮厚耐藏，因此有“天然水果罐头”的称号［1］。柚子成熟后富含糖类，还有抗坏血酸和一些酶类，整体存放的柚子可以维持较常时间。但是在加工过程和存放过程中，颜色会逐渐变深严重影响观感质量和产品的商品市场价值。褐变是柚子加工过程中最容易发生的现象，褐变一般有两种:一种是非酶褐变，这种褐变加工品不仅颜色变深，同时还发生其他一些生化反应，破坏营养成分，影响制品风味，产品品质下降，柚子产品一般会在高温灭菌过程中发生美拉德反应;另一种是酶促褐变，柚子中的单宁等物质在多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，PPO)和过氧化物酶(Peroxidase，POD)作用下生成褐色产物［2］。本文对梅州金柚果肉中多酚氧化酶的性质进行研究，为进一步利用这优良资源，科学控制深加工过程中的酶促褐变提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

梅州金柚 市售;丙酮、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、柠檬酸、巴比妥钠、盐酸、邻苯二酚 分析纯。

JM－L50胶体磨 温州市龙湾永兴张祥胶体磨厂;UV6100A紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;5418小型高速离心机 德国eppendorf有限公司;TC10K电子天平 美国双杰兄弟(集团)有限公司;B11－2转速数显恒温磁力搅拌器 上海司乐仪器有限公司;HH－2数显恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司

1.2 粗酶液的制备［3］

将柚子去皮、去囊，将一定量柚子肉在胶体磨中打成浆状，量取 100mL肉浆，加入 200mL丙酮(－20℃)，高速搅拌2min，用布氏漏斗抽滤，滤饼用200mL丙酮(－20℃)再次抽滤，丙酮粉置于蒸发皿中，用冷风将残留的丙酮吹干，约得丙酮粉12g，置于－20℃下存放。取丙酮粉 1.0g，加入 100mL预冷(4℃)磷酸缓冲溶液(0.05mol/L，pH6.4)，磁力搅拌30min，高速冷冻离心以5000r/min离心10min，上清液过滤即得PPO粗酶液。

1.3 PPO酶活力的测定

参比液为2.0mL磷酸缓冲溶液(0.05mol/L、pH6.4)、2mol/L邻苯二酚1.0mL，摇匀后在60℃水浴中预热10min;待测液为1.5mL磷酸缓冲溶液(0.05mol/L、pH6.4)、2mol/L 邻苯二酚 1.0mL，摇匀在60℃水浴中预热10min，测定前再加入预热(60℃)的PPO粗酶液0.5mL，马上在422nm波长下进行比色测定，酶液加入后开始计时，每1s记录一次吸光值OD值，共记录5min，对照不加酶液的参比液，酶活性以1min OD值每增0.001为一个活力单位。

1.4 不同酶促反应时间的反应产物的最大吸收波长

按照1.3中测定酶活性方法加入底物及粗酶液，在UV6100A紫外可见分光光度计下于350～600nm波长范围内，连续扫描待测液5次，获得不同酶促反应时间的吸收光谱。每次扫描间隔20s，5次扫描共计酶催化底物反应100s。从5次扫描的吸收光谱中可得到每次扫描时的最大吸收波长λmax，及其在此最大吸收波长下的吸光度值。

1.5 PPO最适反应pH的测定

配制 pH 为 3、4、5、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、8、9的一系列缓冲溶液，按照1.3中方法测定不同pH下PPO活性的变化。以最高酶活力为100%，计算PPO相对酶活。

1.6 PPO最适反应温度的测定

取磷酸缓冲溶液液20mL，邻苯二酚溶液10mL和 PPO 粗酶液 5mL 分别在 30、40、50、60、70、80、90℃的水浴中保温10min，按照1.3中的方法测定不同温度下PPO活性的变化。以最高酶活力为100%，计算PPO相对酶活。

1.7 底物浓度与反应速率的关系以及PPO米氏常数Km值的测定

分别配制浓度为 0.5、1、2、3、3.5、4、4.5 mol/L 的邻苯二酚溶液，按照1.3中的方法进行测定，比较不同底物浓度下PPO的活性变化。并求出相应的反应速率(以 ΔA/min来表示)，根据 Lineweaver和 Burk提出的双倒数法作图求出Km和Vmax值。

1.8 PPO的热稳定性研究

取磷酸缓冲溶液液20mL，邻苯二酚溶液10mL和 PPO 粗酶液5mL 分别在 30、40、50、60、70、80、90、100℃的水浴中保温30min，马上冷却至室温，再分别在60℃下保温10min，按照1.3中的方法测定不同温度下PPO的稳定性。以最高酶活力为100%，计算PPO相对酶活。

2 结果与分析

2.1 不同酶促反应时间的反应产物的最大吸收波长

图1所示为第1至第5次扫描的吸收光谱。由测定方法可知，第1至第5次扫描反映了不同酶促反应时间的吸收光谱的变化，每次扫描间隔20s，即第1次扫描结果是反应前20s的吸收光谱，第2次扫描结果是反应第21s至40s的吸收光谱，以此类推。由图可知，PPO催化的邻苯二酚反应产物在可见光范围有一个明显吸收峰，且不同时间扫描得到的吸收光谱特征相似。在第一次扫描所得的λmax为422nm，第5次扫描时λmax已增加为424nm。这说明随着酶促反应时间的延长，反应产物在可见光范围内的最大吸收波长，即λmax在不断增大，向长波长方向偏移。这是由于PPO能催化邻苯二酚变成醌，醌进一步聚合，最后生成黑色素，醌的进一步聚合，无需酶的催化可自动进行，因此当PPO催化生成醌这一产物后，醌会自动进一步向结构更为复杂的黑色素形成方向转化，所以酶促反应至一段时间后，λmax会不断增大，向长波长方向偏移［4］。不同来源的PPO，以邻苯二酚为底物的产物最大吸收波长大部分都在410～420nm范围 内［5］，例如牛蒡为 410nm［6］，华北落叶松为420nm［7］，蕨菜为 415nm［3］;但也有部分来源的 PPO最大吸收波长不在此范围内，如荔枝果肉为398nm［8］，紫甘薯为 370nm［9］。本实验测得金柚果肉中PPO以邻苯二酚为底物在422nm处有最大吸光值，所以在之后实验中均取422nm为其测定波长。

图1 酶促反应产物的吸收光谱Fig.1 Absorption spectrum of product

2.2 PPO最适反应pH的测定

为了准确地找出金柚果肉PPO的最适pH范围，实验首先在较广泛pH(3.0～9.0)范围内进行，然后在酶活较高的pH(5.8～7.4)范围内再细分测定，图2中只表示出有代表性的点。由图2可知，金柚果肉PPO酶活性对环境酸碱度非常敏感，当pH在6.0～6.6范围内表现出较高活性;当pH小于5.0或者大于7.0时，活性迅速下降;在pH为3.0和9.0时，PPO活性分别只有最大时的7.6%和24.6%。其活性在测定范围内pH变化的趋势近似单钟形，在pH6.2时酶活最高，在6.0～6.6范围内酶活较高。由此推断在金柚加工过程中，适当控制pH可以抑制酶的活性，也能明显减轻褐变发生。这是因为PPO的辅基Cu2+，其作用的机制就在于铜的氧化还原作用，在pH较低的强酸形条件下，酶中的铜离子被解离出来，使酶失去活性，从而防止褐变产生，在pH高的强碱性环境中，Cu2+转化为沉淀，脱离了酶蛋白，也能使酶失去活性［10］。

图2 PPO的最适反应pHFig.2 The optimum pH for PPO from pomelo

一般来说，各种来源的PPO最适pH都在中性(6.0～7.4)附近［11］，大多在7.0～7.4 范围。很多文献都有关于PPO最适pH的报道，例如以邻苯二酚为底物，草莓PPO的最适pH为5.5，苹果为pH6.0，茄子为 pH7.0，葱为 pH7.5，大蔷薇为 pH8.5 等［12］。本实验测得金柚果肉PPO的最适pH范围为6.0～6.6，与其它来源的PPO较为接近，可在加工过程中采用与其他果蔬类似的方法控制pH。

2.3 PPO最适反应温度的测定

图3为PPO粗酶液和底物分别在不同温度下处理10min，再混合进行测定的效果图。由图3可知，温度在50～70℃之间金柚果肉PPO活性保持较高值。在温度较低(20～50℃)时，随温度升高活性增加，在温度高于70℃时，随着温度的升高，酶活性明显降低。温度对PPO的影响数双重的，一方面温度升高能加快酶催化反应速度的进程，另一方面促使酶蛋白变性，是两种作用的综合［9］。据文献报道，大部分不同来源的PPO最适温度皆在20～35℃范围，例如梨为 20℃，葡萄为 25℃，梅子为 37℃等［13］，通常在70℃以上短时高温处理即为有效钝化酶的活性。本实验所得金柚果肉PPO的最适反应温度与其他来源PPO相似。

图3 PPO的最适反应温度Fig.3 The optimum temperature for PPO from pomelo

2.4 底物浓度和PPO活性的关系

由图4可以看出，底物在低浓度时(＜1mol/L)，底物浓度和反应速率有一定的正比关系，随着底物浓度的增加，反应速率也相应地增加;当底物达到一定浓度(≥2mol/L)，底物浓度再增加，反应速率接近平缓，不再具有线性关系;但底物浓度进一步增大(≥3.5mol/L)，吸光值的变化随着浓度的增大反而降低。说明金柚果肉PPO的最适反应底物浓度为2mol/L，再增加底物浓度对酶的活性作用不大。这是因为底物浓度较低时，有一些酶的活性部位并没有与底物结合，随着底物浓度增加，越来越多的酶活性部位与底物结合，使酶促反应进行，在达到一定浓度后，所有的酶活性部位都与底物结合，此时，酶活性部位被底物饱和，进一步提高底物浓度也不能提高酶活，酶活力达到最大值［14］。这个结论与Michaelis－Menten假说是相一致的，可根据Lineweaver和Burk提出的双倒数法作图求出Km和Vmax值。

2.5 PPO热稳定性研究

图4 底物浓度与反应速率的关系Fig.4 The relationship between substrate concentration and reaction rate

将粗酶液和底物分别在 30、40、50、60、70、80、90、100℃保温30min后，再调至最适温度60℃测定PPO活性，得到结果如图5。由图5可知，高于80℃处理的酶液，活性迅速下降，90℃处理30min后，PPO活力只有最大时的16.8%。因此在实际生产中，可采用热烫处理，降低直至破坏果蔬组织中的PPO活性，从而控制果蔬的酶促褐变。

图5 米氏常数的测定Fig.5 The Lineweaver－Burk plots of enzyme－catalyzed reaction of PPO from pomelo

图6 PPO的热稳定性Fig.6 Thermal stability of PPO from pomelo

3 结论

金柚果肉中PPO的最大吸收波长为422nm，最适pH范围为6.0～6.6。PPO的最适温度范围为50～70℃;经过PPO的热稳性实验:表明金柚果肉中PPO要经过80℃以上处理才开始被钝化。动力学研究表明，底物浓度与金柚果肉PPO活性的关系遵循Michealis－Menten的酶促动力学。以邻苯二酚为底物，在本实验条件下(pH6.4，60℃)，米氏常数 Km=0.947mol/L，最大反应速率Vmax=0.375U/min。经比较，金柚果肉PPO与其他来源PPO的特性基本相似，因此可利用常见的果蔬处理方法来抑制金柚在贮运和加工过程发生的褐变。

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