许爱清，周士镭，冯杏杏，罗玉金，吴禹恒

(湖南科技大学生命科学学院，湖南湘潭411201)

墨鱼(乌贼，Sepia officinalis)是一种名贵的海产品，市场中主要有两种产品形式:冰冻墨鱼鲜品和盐渍风干后的墨鱼干制品。出于保鲜和安全的考虑，人们对冰冻墨鱼的微生物检测关注度较高，研究人员从意大利生产和马来西亚进口冷冻墨鱼中分离到嗜盐性的副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)［1－2］，认为冰冻墨鱼是这种能引起消费者发生急性肠胃炎致病菌的重要载体;研究也发现依赖NaCl生长的假单胞菌(Pseudomonas)是葡萄牙产冰冻保鲜墨鱼的主要腐败菌［3］。墨鱼干是新鲜墨鱼经过盐渍蒸熟、晾晒风干后制成的墨鱼制品，在市售墨鱼干表面常见有盐渍菌斑，但是对干制墨鱼产品的微生物检测鲜见报道。本研究对菌斑中的耐(嗜)盐细菌进行了分离纯化，并对一株嗜盐菌进行了系统发育分析，检测了其部分生物学特性。研究结果能为了解墨鱼干表面菌斑中微生物种类与特性，以及对其生长的控制提供参考，有助于提高墨鱼干产品的品质。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

墨鱼干，表面有明显的白霜状盐渍菌斑 市售;含5%NaCl培养基:0.5%蛋白胨，0.5%牛肉膏，5%NaCl，自来水配制，pH 自然，121℃ 灭菌25min。制备固体培养基时需添加2%的琼脂粉;含TaKaRa Taq(5U/μL)和10 × PCR 缓冲液(含 MgCl2，15mmol/L)的TaKaRa TaqTMDNA多聚酶试剂盒 宝生物工程(大连)有限公司;dNTPs(各 2.5mmol/L)、16S rDNA PCR通用引物:27F(5′－AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG－3′)、1492R(5′－GGY TAC CTT GTT ACG ACT T－3′) 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;其它试剂均为进口或国产分析纯。

MycyclerTMThermal Cycler PCR 仪、PowerPacTMBasic电泳仪 美国Bio－Rad公司;Kodak Gel Logic 212凝胶成像系统 Carestream Health INC.USA;752型紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;CT15RT通用冷冻离心机 上海天美(Techcomp)公司;SP500自动高压蒸汽灭菌器 日本Yamato公司;SPX－250BS－II生化培养箱 上海新苗医疗器械制造公司;江南YS100生物显微镜 南京江南永新光学有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 嗜盐菌的分离纯化 取一片完整的墨鱼干，刮取其带白霜部位表面碎屑少许，悬浮于含5%NaCl液体培养基，25℃，150r/min振荡培养24h富集耐盐细菌。制成的菌悬液经适度稀释，涂布于含5%NaCl培养基固体平板，25℃培养48h，挑取单菌落，继续划线分离纯化后，转接到含5%NaCl培养基斜面，4℃保存。

1.2.2 菌株的形态学观测 移取5%NaCl液体培养基中菌体制成涂片，经石碳酸复红单染色，普通光学显微镜油镜下观测菌体形态。

1.2.3 耐盐度测定 液体菌种是将斜面上菌苔转接到含5%NaCl液体培养基，25℃、150r/min振荡培养24h的菌悬液。菌种稀释液组成为用0.5%蛋白胨和0.5%牛肉膏的去离子水溶液。将液体菌种稀释100倍以降低菌种液的盐度，再按1%量接种于NaCl浓度为 0%、0.5%、1%、2%、3%、5%、8%、10%、12%、15%、20%、25%、30%和32%的液体培养基，25℃、150r/min振荡培养24～48h，观察比较菌悬液的浑浊度，评判菌的生长状态。

1.2.4 16S rRNA基因序列分析 将受试菌株培养于含5%NaCl液体培养基后，离心收集菌体细胞，通过SDS碱裂解法抽提细菌基因组DNA［4］，以1.0%琼脂糖电泳检验 DNA纯度，－20℃保存备用。用16S rDNA通用引物27F和1492R进行PCR扩增菌株16S rRNA基因。PCR反应体系:10×PCR Buffer(Mg2+Plus)5.0μL、dNTPs(各 2.5mmol)1.0μL、引物27F(20μmol/L)和 1492R(20μmol/L)各 1.0μL、TaKaRa Taq(5U/μL)0.25μL、DNA 模板 1.0μL，补加灭菌蒸馏水至50μL。PCR扩增反应条件:95℃预变性 4min;然后 95℃ 变性 50s，52℃ 退火 1min，72℃延伸2min，共30个循环;最后72℃延伸10min。PCR产物经1.0%琼脂糖电泳检测，纯化后送交生工生物工程(上海)股份有限公司测序。双向测定的16S rDNA序列合并后，通过 blastN(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)程序在GenBank中搜索比对相似序列，以 E值(Expectation values)＜1.0e－05为标准判别同源比对具有显著性意义，指示两者为同源序列。并通过 BankIt软件提交序列到GenBank中。

参照 LPSN(ListofProkaryoticnameswith Standing in Nomenclature)数据库中盐单胞菌属(Halomonas)和栖盐田菌属(Salinicola)的菌种名和模式菌株在GenBank/EMBL/DDBJ数据库中的登录号(http://www.bacterio.cict.fr/h/halomonas.html)，从GenBank的nucleotide数据库中搜索选择一些模式菌株的16S rDNA序列。所选择的盐单胞菌属的模式菌株至少具有特征之一:分离自中国的盐湖海水等环境中;分离来自韩国等传统发酵海产食品基质;是耐盐菌，在0%～20%NaCl盐度下能生长。首先，将模式菌株与待测菌株的16S rDNA序列用ClustalW 1.83程序进行多序列比对;然后，利用分子进化遗传分析软件MEGA5.10构建N－J系统发生树(Neighbor－Joining tree)，基本参数:系统发育树可靠性检验的自举值(Bootstrap Value)设定为1000次;替代模型(Substitution Model)选择 Kimura 2－parameter model。以棕榈发酵细菌(Zymobacter palmae)的模式菌株作外群［5］，分析待测菌株的系统发育地位。

1.2.5 温度对菌株生长的影响 将新鲜菌液按1%接种量接种于含5%NaCl培养基中，置于5、10、15、25、37、42、45、50℃等温度下，150r/min 振荡培养24～72h，观测比较培养液浊度。

1.2.6 硝酸盐浓度的影响及硝酸盐还原作用检测含NaNO3培养基:0.5%蛋白胨，0.5%牛肉膏，按需要添加调整NaNO3的质量百分比浓度，自来水配制，pH自然，121℃灭菌25min。

取5%NaCl液体培养基中新鲜菌种悬液，按1%接种量接种含NaNO3浓度为0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%的液体培养基，25℃，150r/min培养24～72h，测定菌株对硝酸盐浓度的耐受性。

为检测菌株生长过程中能否产生亚硝酸盐，每12h移取含2%NaNO3培养液中菌悬液，经10000×g离心去除菌体，向2mL上清液中依次加入100μL 0.4%对氨基苯磺酸溶液和100μL 0.2%盐酸萘乙二胺溶液，溶液变为(粉)红色则判定菌株能将硝酸盐转化成亚硝酸盐(NaNO2)，即具有硝酸盐还原作用为阳性;若该反应为阴性，则往上清液中加少量锌粉将硝酸根还原成亚硝酸根后，再根据颜色反应来确认反应结果［6］。

1.2.7 食品防腐剂的影响 参照在水产或肉制品中容许使用的防腐剂及其最大使用量［7］，选用食品级规格的山梨酸钾(最大容许剂量为0.1%)、苯甲酸钠(0.1%)、脱氢乙酸钠(0.05%)、双乙酸钠(0.1%)、焦亚硫酸钠(0.01%)和乳酸链球菌素(Nisin，0.05%)。在含5%NaCl培养基中分别添加各种防腐抑菌剂至最大容许剂量和对倍稀释剂量，取5%NaCl培养液中菌种按1%量接种后，25℃，150r/min培养24～72h，观测比较培养液浊度，检测各种防腐剂的最小抑制浓度。

2 结果与讨论

2.1 结果分析

2.1.1 菌株的形态 墨鱼干表面碎屑在5%NaCl液体培养基中富集培养24h，生长出较浓浊的菌悬液。经涂布平板和单菌落划线分离，得到一个耐盐菌株NYJ01。它在5%NaCl固体培养基上，28℃、48h生长的菌落形态和显微镜(油镜)下的菌体形态见图1。菌落呈乳白色、隆起、边缘整齐、菌落直径 0.5～1.5mm。菌体细胞为球状或短杆状，单个排列。

图1 菌株NYJ01的菌落和细胞形态Fig.1 Morphology of colony and cells of the strain NYJ01

2.1.2 16S rRNA基因序列分析 对菌株NYJ01的16S rDNA进行PCR扩增，PCR产物测序得到1462nt核苷酸序列，在 GenBank中提交的登录号是KC854246。将序列在GenBank数据库进行BLAST搜索比对，结果表明它与盐单胞菌属和栖盐田菌属中一些菌株的16S rDNA序列的一致性高达99%。选择这两个属中模式菌株与菌株NYJ01的16S rDNA序列构建出的系统发育树如图2所示。系统发育分析显示菌株NYJ01与栖盐田菌属细菌聚类为一个分枝，尤其是与该属的模式菌株关联栖盐田菌(Salinicola socius)之间的亲缘关系最近。因此，可以确定菌株NYJ01是一种栖盐田菌，暂定为Salinicola sp.NYJ01。

2.1.3 菌株的部分生理特性 菌株Salinicola sp.NYJ01的耐盐性测定结果显示:在同样接种量的情况下，在仅含NaCl为无机盐的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，1%～20%NaCl范围内都能生长，最适范围是3%～10%NaCl，其菌悬液最浑浊，可见大量的细胞凝聚团块。菌株的耐盐性表明菌株NYJ01是一种中度嗜盐菌。

菌株NYJ01的生长温度范围是10～45℃，其最适范围是25～37℃。在25℃以下，菌体生长缓慢，尤其是在10℃左右时，经72h振荡培养后培养液浊度无明显变化。结果表明菌株NYJ01是一种中温菌，可以利用10℃以下低温抑制其生长繁殖。

表1 菌株NYJ01与盐田菌属细菌的部分表型特性对照Table 1 Differential phenotypic characteristics of the strain NYJ01 and the close related Salinicola species

图2 基于16S rRNA基因构建的N－J系统发育一致树Fig.2 Neighbor－joining phylogenetic consensus tree based on the 16S rRNA gene sequences

菌株NYJ01能在仅含0.5%～15%NaNO3为无机盐的牛肉膏蛋白胨培养液中生长。含NaNO3培养液离心后，上清液中加入亚硝酸盐测定试剂，溶液不变红色，表明它不能将硝酸盐还原成亚硝酸盐，即硝酸盐还原作用阴性。可以推断菌株在高盐食品基质上生长，不会引起亚硝酸盐危害。

菌株NYJ01与盐田菌属细菌的部分表型特性列举见表1。对照结果表明菌株NYJ01与同属的4个模式菌株在生理特性上不完全相同，可能是一种新种或者是变种。

2.1.4 食品防腐剂对菌株生长的影响 选用6种食品级规格的防腐剂，以食品添加剂使用标准［7］中最大容许使用量为上限，经对倍稀释处理后，添加到5%NaCl牛肉膏蛋白胨液体培养基中，接种NYJ01，25℃培养72h的后，菌体细胞的生长情况见表2。

表2 食品防腐剂对菌株NYJ01生长的影响Table 2 Effect of some food preservatives on the growth of strain NYJ01

表2数据表明:在食品中添加的最大容许剂量下，焦亚硫酸钠(0.01%)和乳酸链球菌素(Nisin，0.05%)不能抑制菌株NYJ01生长;而其它几种食品防腐剂在最大容许剂量下都能抑制菌株NYJ01生长，并且在对倍稀释后都有不同程度的抑制作用。可利用0.025%双乙酸钠、0.05%山梨酸钾、0.05%苯甲酸钠或0.05%脱氢乙酸钠分别抑制菌株NYJ01生长。

2.2 讨论

2.2.1 耐盐菌NYJ01的分类地位 本次分离所得菌株NYJ01的16S rDNA序列与盐单胞菌属和栖盐田菌属的一些菌株一致性达到99%。盐单胞菌属广泛分布于含盐环境，如海水、盐湖、盐田或人工盐水。在伯杰氏手册中仅描述了23种［8］。近年来，陆续发现盐单胞菌属中的很多新种，最新发布的盐单胞菌属中已有 83个有效菌种名(http://www.bacterio.cict.fr/h/halomonas.html)。就细胞形态和分离基质来说，仅有盐脱氮盐单胞菌(H.halodenitrificans)为球状或短杆状，最初分离自腌肉的盐水中;食物盐单胞菌(H.alimentaria)是球状或短杆状，分离自韩国传统发酵海产品(jeotgal，飞翅鱼)［9］。除菌体形态相似，在细菌耐盐性和生长温度范围方面，菌株NYJ01与上述分离自食品基质的中度嗜盐菌有明显的不同。系统发育分析结果表明，在国内分离所得的十多种盐单胞菌属细菌在系统发育树上分布比较离散，菌株NYJ01与该属的盐渍盐单胞菌(H.salaria)具有最近的亲缘关系，但该种已经转变为栖盐田菌属新种［10］。

栖盐田菌属是一个2007年建立的新属［11］。属的模式种是关联栖盐田菌，其它有效种包括盐栖盐田菌和嗜盐栖盐田菌(S.halophilus)［10］，以及中国学者(2013年)从养鸡场土壤中分离鉴定的新种——泽澍栖盐田菌(S.zeshunii)［12］。系统发育分析结果表明，菌株NYJ01与该属的所有模式菌株聚类为一个分枝，而且与模式种关联栖盐田菌之间的亲缘关系最近。菌株NYJ01是栖盐田菌属的成员之一，但由于在部分生理特性方面，它又与4种栖盐田菌之间不完全相同。因此，菌株NYJ01是否是栖盐田菌属的一个新种或变种，需要做详尽的生理生化实验才能予以确定。

2.2.2 耐盐菌NYJ01在墨鱼干上的功能 墨鱼(乌贼)作为一种营养和药用价值较高的海产品，生产加工的墨鱼干产品会不可避免地携带海生的耐盐微生物，因此，在墨鱼干产品表面经常可见到盐渍白斑。本次鉴定的嗜盐菌菌株NYJ01，分离自墨鱼干带菌斑的表面，表明该菌与菌斑的形成存在一定关联。菌株NYJ01生长的营养要求简单，适应性强，耐盐范围和温度范围都比较广泛，只要提供适宜温度和盐度，就能大量生长繁殖。一方面，如果认为该菌是墨鱼干产品的污染菌而有必要控制其生长繁殖，本研究提供了一些基础数据，即可以使用食品防腐剂，例如0.025%双乙酸钠、0.05%山梨酸钾、0.05%苯甲酸钠或0.05%脱氢乙酸钠分别抑制菌株NYJ01生长。还可以采用10℃以下的低温控制这种细菌的生长繁殖。

另一方面，可以认为墨鱼干产品表面生长耐盐菌是一种自然发酵过程。迄今未见到因食用有嗜盐菌生长(或污染)的墨鱼干而引起食品安全问题的报道。本实验表明菌株NYJ01属于硝酸盐还原阴性细菌，它不会引起食品中亚硝酸盐危害的问题，可以认为菌株NYJ01是一种食用安全风险较低的细菌。嗜盐菌的生长过程中能产生大量蛋白酶和核酸酶，它们分解蛋白质产生谷氨酸，以及促使核酸分解产生核苷酸，这可能与日常饮食中用墨鱼干熬制的汤汁非常鲜美有关。此外，资料表明能适应生存于相当广泛盐度范围的嗜盐菌，其对高盐度的适应机制之一是“胞内有机溶质策略”，即在细胞内合成或积累大量的相容性溶质分子，例如四氢嘧啶(ectione)和甜菜碱(glycine betaine)等，并将盐排出细胞质［13］。嗜盐菌产生的四氢嘧啶等相容性物质对蛋白质和细胞结构具有保护作用，它们是一类有待开发的极具潜力的功能食品添加剂［14］。就这方面来说，菌株NYJ01存在于墨鱼干产品中则具有积极的意义。

3 结论

本实验从市售墨鱼干表面分离纯化出一株嗜盐菌NYJ01。通过16S rDNA测序和系统发育分析表明它是一种盐田菌属细菌(Salinicola sp.)。这种中度嗜盐菌能在1%～20%NaCl浓度下生长，最适浓度是3%～10%NaCl;生长温度范围是10～45℃，最适温度是25～37℃，可以利用10℃以下低温抑制其生长繁殖;它不具有硝酸盐还原作用，不会引起墨鱼干制品产生亚硝酸盐危害;可利用0.025%双乙酸钠、0.05%山梨酸钾、0.05%苯甲酸钠或0.05%脱氢乙酸钠分别抑制菌株NYJ01生长。

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