秦娜娜，侯伟伟，张双双，李天兰，李 可，杨海燕

(新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐830052)

目前，中国有马近 892×104匹，居世界第一［1］。新疆有马102.5×104匹，与内蒙古(108.4×104匹)相近，居全国第二［2］。生马骨中蛋白质和脂肪含量分别为12.8%和8.5%，骨中含有构成蛋白质的所有氨基酸，且比例均衡、必需氨基酸水平高，属于优质蛋白［3－4］。人们通过对酶解机理、酶解原料、酶及酶解液等方面进行了大量的深入研究［5］，发现酶法水解优点体现在温和，易控、有定向、反应时间短，无环境污染，产品营养价值高等。利用可控酶解技术水解骨蛋白，作为保健品的重要基料，具有良好的加工特性、营养功能和生理活性，符合当前消费者对畜禽产品“天然、营养、安全、健康”的消费趋势［6－8］。在国内对骨的利用还停留在落后阶段，只是将骨熬汤，制成骨胶等食品添加剂［9］。近些年随着消费观念的转变，“以骨补骨”的意识不断增强，骨食品在研发方面取得了明显的成绩。在国外骨食品的开发已经很普遍，采用超微粉碎技术生产食用骨粉、骨糊、骨胶、骨浆、骨肉蛋白粉及骨提取物等各种骨产品及高质量蛋白质。本实验以氮收率和水解度为指标，在单因素基础上，采用二次旋转组合设计实验优化最佳酶解工艺条件［10］。针对熏马肉、熏马肠中剩余副产物马骨进行综合利用，形成具有较高副加值产品，这样不仅可以减少骨资源的浪费，获得更大的经济效益，更重要的是通过加工工艺的改进，丰富了消费者食材。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

生马骨 新疆霍城县马产业基地;胃蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶 南宁庞博生物技术有限公司;正己烷、浓硫酸、氢氧化钠 天津市福晨化学试剂厂;硫酸铜、硫酸钾 天津市化学试剂三厂;甲基红指示剂(C15H15N3O2)、溴甲酚绿指示剂(C21H14Br4O5S)等 均为分析纯。

AL204－1C电子分析天平 梅特勒托利多仪器有限公司;HH－2型数显恒温水浴锅 上海博迅实业有限公司;凯氏定氮装置 四川(崇州)蜀玻有限公司;TDL－5离心机 上海安亭科学仪器厂;pH计 德国Sartorius公司;PL3000真空冷冻干燥仪 Thermo公司。

1.2 实验方法

1.2.1 水解度的测定方法 邻苯二甲醛滴定法［11］。水解度(%)=水解液中的总游离氨基酸态氮含量/原料中的总氮量×100

1.2.2 氮收率的测定方法［12］根据公式计算氮收率:氮收率(%)=水解液中蛋白含量/原料中蛋白质含量×100

1.2.3 工艺流程

1.2.4 酶种类的筛选 根据酶切位点的不同，分别采用碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶及胃蛋白酶在其各自的最适温度、pH条件下，料液比 1∶6g/mL、加酶量 6000U/g、酶解时间 4h，对马骨蛋白进行水解，以水解度、氮收率来确定最佳用酶。

1.2.5 单因素实验 确定酶解温度、料液比、pH、加酶量、时间五个因素，对氮收率和水解度的影响。

1.2.6 响应面法优化酶解工艺 在单因素实验的基础上，运用Box－Behnken的中心组合设计原理，在酶解时间已经确定的基础上，以水解度为响应值，选择酶解温度、料液比、pH、加酶量，进行四因素三水平响应面优化实验［10］。见表 1。

表1 实验因素水平表Table 1 The factor and level of test

2 结果与分析

2.1 酶种类的筛选结果

由图1可知，马骨粉未加酶的水解度和氮收率较低，添加酶后都有增加，其中碱性蛋白酶水解度、氮收率均最高，分别为:14.41%、68.25%，因此选择碱性蛋白酶为水解用酶。5种不同蛋白酶对马骨粉水解的影响顺序为:碱性蛋白酶＞胃蛋白酶＞胰蛋白酶＞中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶。

图1 酶种类的筛选Fig.1 Select about the types of the enzyme

2.2 单因素实验结果

2.2.1 温度对酶解的影响 由图2可知，随着酶解温度的增加水解度和氮收率都增加，50℃时数值最大，大于50℃其数值有显著下降趋势。因为，低于酶的最适温度，酶的活性比较小，高于酶的最适温度会导致酶部分或全部失活，酶活力会迅速下降［13］。

图2 温度对酶解的影响Fig.2 The influence of temperature on enzymatic hydrolysis

2.2.2 料液比对酶解的影响 由图3可知，马骨粉酶解液的水解度和氮收率都是伴随着料液比的不断降低呈上升的趋势，这主要是因为料液比越大，酶和底物接触不充分，造成样品中碱性蛋白质酶解不完全。料液比越小，碱性蛋白酶和底物接触的位点越充分，但是如果马骨粉酶解液中可溶性的固形物含量太低，则不利于酶解液的冷冻干燥。因此，结合实际情况，选择适宜的料液比为1∶6g/mL。

图3 料液比对酶解的影响Fig.3 The influence of solid－liquid ratio on enzymatic hydrolysis

2.2.3 pH对酶解的影响 pH是影响酶活力的重要因素之一，因为酶要发挥其催化功能，活性基团部位必须有一定的解离形式。pH会影响酶分子的构象和酶分子及底物的解离状态，从而影响酶活性和酶促反应速度，pH过高或过低都不利于酶解反应。由图4可知，pH为9时马骨粉的水解度和氮收率最高。低于最适pH酶活力比较小，高于最适pH酶部分失活或全部失活，导致水解度和氮收率均下降［14］。

图4 pH对酶解的影响Fig.4 The influence of pH on enzymatic hydrolysis

2.2.4 加酶量对酶解的影响 由图5可知，随着加酶量的增加，马骨粉的氮收率和水解度在增加，低于6000U/g水解度和氮收率增加较快，高于6000U/g增加缓慢。随着加酶量的增加，酶与底物不断增加位点接触，加酶量在6000U/g时，酶与底物的接触位点已经比较充分，再增加酶用量其水解度和氮收率变化不大，因此选择最适的加酶量为6000U/g。

图5 加酶量对酶解的影响Fig.5 The influence enzymatic hydrolysis of enzyme

2.2.5 时间对酶解的影响 由图6可知，随着酶解时间的延长，水解度和氮收率显著增加，4h时达最大值，大于4h趋于稳定。因为酶解时间过短，蛋白水解不完全，随时间的延长，蛋白充分酶解，当酶解达到最大，增加酶解时间不会增加水解程度。因此，选择酶解时间为4h最佳。

图6 时间对酶解的影响Fig.6 The influence of time on enzymatic hydrolysis

2.2.6 响应面实验设计结果 运用Design Expert8.0Trial设计，展开29组实验，结果见表2。

根据表3所得的实验数据，运用Design Expert8.0 Trial统计软件进行处理，采用响应曲面统计方法对实验数据进行拟合，建立酶解温度、料液比、酶解pH与加酶量四因子的二次多项数学回归方程:

Y=18.40－2.63X1+0.53X2－0.092X3+0.7X4+0.55X1X2－0.42X1X3+0.15X1X4+0.72X2X3－1.62X2X4+0.13X3X4－2.26X12－1.72X22－2.31X32－1.75X42

进一步对该回归模型的显著性进行检验，响应曲面的数据方差分析结果见表3，分析结果显示模型的 F=59.36＞F0.05(14，14)=2.48，p＜0.0001，表明回归模型极显著。失拟项 F=1.92＜F0.05(14，10)=2.60，p=0.2776＞0.05，不显著，说明该模型拟合程度良好，实验误差小。因此，可以选择用此模型来分析和预测酶解法制取马骨营养多肽粉的工艺结果。同时一次项 X1、X2、X4极显著，交叉项 X2X3、X2X4极显著、X1X2显著，平方项值都是极显著性影响。最佳实验结果:酶解温度47.1℃，料液比1∶6.98g/mL，酶解pH9.02，加酶量6180U/g。结合实际操作条件，酶解温度 47℃，料液比1∶7g/mL，酶解 pH9，加酶量6200U/g，此时最大的水解度为17.8%。

表2 Box－Behnken实验设计及结果Table 2 The design and results of Box－Behnken

通过3组平行实验，检验模型预测的准确性。所得酶解最大水解度平均值为17.47%(误差值小于0.05%)。建立的模型比较符合实际情况，响应面法优化酶解马骨粉工艺参数可行。

2.2.7 响应曲面模型结果分析 通过对模型的响应面以及相对应的等高线图进行分析，得出各因素的交互作用对酶解的影响和预测最优值，并对模型的预测最优值进行验证，从而确定预处理工艺酶解的最佳条件。模型的响应曲面及其等高线见图7～图9。

响应曲面出现最高点，在等高线面具有椭圆形中心区域，说明因素在所选择范围内能产生最佳的响应值，因素的选择在实验范围内合理并且有效，能够反映出响应值的影响趋势。响应曲面坡度较大，未出现最高点;在等高线面上具有部分椭圆形中心区域，表明具有交互作用，但无最佳响应值。极值条件应在等高线的椭圆圆心处。由图7～图9和表3可知，酶解温度与料液比对马骨脱脂中总蛋白质含量的交互作用显著，料液比与pH、料液比与加酶量的交互作用极显著。

表3 回归模型方差分析及模型系数显著性检验Table 3 The Variance analysis and coefficients significant inspection of the model

图7 Y=f(X1，X2)响应曲面立体图及等高线Fig.7 Response surface plot and contour map plot for Y=f(X1，X2)

图8 Y=f(X2，X3)响应曲面立体图及等高线Fig.8 Response surface plot and contour map plot for Y=f(X2，X3)

3 结论

图9 Y=f(X2，X4)响应曲面立体图及等高线Fig.9 Response surface plot and contour map plot for Y=f(X2，X4)

本实验以脱脂马骨粉为原料，以水解度和氮收率为响应值，对5种蛋白酶进行比较，选择碱性蛋白酶为水解用酶。在单因素的基础上，通过二次旋转组合设计优化最佳酶解工艺参数为:酶解温度47℃，料液比 1∶7g/mL，酶解 pH9，加酶量 6200U/g，酶解时间4h，在该条件下水解度为17.47%。通过本实验实验可以看出，酶解法可以显著提高马骨粉水解度和增加马骨粉综合利用。

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