彭 鹏，刘园园，刘爱民，卢存龙，高 娜，马 雪，李瑞萍

(安徽师范大学，生命科学学院生态环境与生态安全安徽省高校重点实验室;重要生物资源的保护和利用研究安徽省重点实验室，安徽芜湖241000)

类胡萝卜素在制药、医学、化妆品、食品和饲料产业中具有重要价值，其中的β－胡萝卜素不仅是维生素A的前体，具有预防眼疾、保护视力的功能，而且还具有抑制细胞变异［1］，抗癌、防癌、抗氧自由基、增强机体抵抗力，维护人体上皮组织的正常生理功能［2］，以及促进儿童生长发育、美容等一系列重要作用［3］，在世界许多国家被广泛用作食品营养强化剂及添加剂［4］。市场上目前存在合成β－胡萝卜素和天然β－胡萝卜素两种［5－6］。合成 β－胡萝卜素有致染色体畸变作用，在西方发达国家已被限制用作食品和饲料添加剂［7］。天然β－胡萝卜素广泛存在于黄色和绿色蔬果中，在某些动物体内也发现含有β－胡萝卜素，其含量有很大差异。随着国内外对天然β－胡萝卜素产品市场需求的增加，采用微生物发酵法生产β－胡萝卜素有广阔的应用前景［8－9］。国内外对于β－胡萝卜素发酵菌株的研究主要集中在三孢布拉氏霉(Blakeslea trispora)和红酵母(Rhodotorula)。三孢布拉氏霉发酵产率虽然较高，但发酵技术工艺复杂、发酵周期长、成本高，不易于产业化［10－11］。红酵母生长速率快、营养要求简单，发酵工艺易于调控，菌体可综合利用，且属于我国饲料行业12种确认的饲用微生物，易于进行大规模培养、具有很高的应用价值和开发前景［10，12－13］。近年来，对红酵母产 β－胡萝卜素研究已有相关报道。何海燕等人［14］以甘蔗糖蜜为碳源，经摇瓶发酵初筛得到一株生物量和胡萝卜素含量均较高的菌株 R3，发酵获得胡萝卜素含量0.767mg/g，胡萝卜素产量为8.70mg/L，生物量达到11.34mg/L。梁晓华等人［15］在最适条件下摇瓶培养Rhodotorula sp.hidai Y2，类胡萝卜素产量达到4.97mg/L。在红酵母产β－胡萝卜素的培养基优化、发酵条件优化及混菌发酵方面也有相关文献。如，张志军等人［16］研究发现蔗糖和葡萄糖作为碳源，对海洋红酵母(Rhodotorula sp.06)的生长和色素的产生最有利，麦芽糖次之，乳糖的生物量最低。Tinoi等人［17］利用绿豆渣作为原料类胡萝卜素产量达到了2.48mg/L。Buzzini［18］优化了一株红酵母的培养条件，类胡萝卜素含量达到803.2μg/g，他还应用分批补料方法，将粘红酵母DBVPG3853与巴德利酵母DBVPG3503共同培养，玉米浆为唯一碳源，结果测得色素产量为 8.2mg/L［19］。本文在对粘红酵母(Rhodotorula glutinis)31229和一株产β－胡萝卜素量较高的红酵母菌株RY－01进行了初步研究的基础上，探讨其混合发酵的培养基与培养条件，并考察几种促进剂对混合发酵中的β－胡萝卜素产量和生物量的影响，为β－胡萝卜素高产菌株的选育和β－胡萝卜素的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

粘红酵母(Rhodotorula glutinis) 编号31229，购自CICC中心;红酵母RY－01 微生物实验室分离并保存。

UV－2000型紫外/可见分光光度计 UNICO公司;JC202型电热恒温干燥箱 上海成顺仪器仪表公司;HYQ－150型生物摇床 武汉汇成生物科技公司;HH－1型数显恒温水浴锅 江苏金坛市亿通电子公司;TDL－40B型低速台式大容量离心机 无锡瑞江分析仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基和培养方法 菌种活化培养基:麦芽汁培养基［20］;斜面培养基:采用 PDA 培养基［20］;种子培养基:采用PDA液体培养基，装液量为100mL/250mL三角瓶;起始发酵培养基:葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏10g，加水至1000mL，pH6.0，装液量为30mL/250mL三角瓶;优化发酵培养基:麦芽糖20g，蛋白胨10g，酵母膏10g，加水至1000mL，pH6.0，装液量为30mL/250mL三角瓶。

种子扩培方法:从斜面上挑取两环菌种，接入种子培养基中，混合种子液为粘红酵母和红酵母RY－01各挑一环接入种子培养基。30℃，180r/min，摇床培养24h。

1.2.2 菌体生物量的测定 取10mL发酵液，4000r/min离心15min，弃上清，用蒸馏水洗涤2次;用蒸馏水将菌体移入预先干燥至恒质量M0的称量瓶中，置60℃电热恒温干燥箱中，干燥至恒质量，用精密电子天平称量称量瓶与菌体总质量M［21］。

细胞生物量公式为:W=1000×(M－M0)/10

式中:W－细胞生物量，g/L;M－称量瓶与菌体的总质量，g;M0－称量瓶的质量，g。

1.2.3 β－胡萝卜素的提取与测定 酸热破壁法破酵母细胞壁，参考文献［11，22］，转速为4000r/min。

β－胡萝卜素的提取与测定方法，参考文献［21］，提取溶剂为丙酮，用紫外/可见分光光度计在波长450nm下测定吸光度值。

β－胡萝卜素质量分数计算公式为:Wc=Aλmax×D×V/0.16m

式中:Wc－发酵液β－胡萝卜素的质量分数，μg/g干菌体;Aλmax－最大吸收波长450nm下的吸光度;D－测定试样的稀释倍数;V－提取色素用有机溶剂体积，mL;m－干酵母菌体质量，g;0.16－β－胡萝卜素的摩尔消光系数，(mol× cm)－1。

β－胡萝卜素产量(μg/L)=β－胡萝卜素含量(μg/g)×细胞生物量(g/L)

1.2.4 实验方法 单菌发酵与混合发酵的比较:将粘红酵母、红酵母RY－01和混合种子液按接种量10%分别接入起始发酵培养基，置于 30℃，180r/min，摇床培养4d后分别测定生物量和β－胡萝卜素产量。

混合发酵培养时间实验:将混合种子液按接种量10%接入优化发酵培养基，于30℃，180r/min，摇床培养。分别在培养 1、2、3、4、5、6d 后测定菌体生物量和β－胡萝卜素含量。

混合发酵碳源实验:培养基为2%碳源，1%氯化铵，0.02%磷酸氢二钾，0.02%硫酸镁，pH6.0，装液量为30mL/250mL三角瓶。以葡萄糖为对照，其他碳源分别为乳糖、半乳糖、淀粉、麦芽糖、甘露醇、甜醇、木糖和吐温－80。将混合种子液按接种量10%接入培养基，于30℃，180r/min，摇床培养4d后分别测定生物量和β－胡萝卜素产量。

混合发酵氮源实验:培养基为2%麦芽糖，1%氮源，0.02%磷酸氢二钾，0.02%硫酸镁，pH6.0，装液量为30mL/250mL三角瓶。以氯化铵为对照，其他氮源分别为蛋白胨、硝酸钾、尿素和硝酸铵。将混合种子液按接种量10%接入培养基，于30℃，180r/min，摇床培养4d后分别测定生物量和β－胡萝卜素产量。

混合发酵无机盐实验:以优化发酵培养基为对照，在优化发酵培养基中分别添加硫酸钾、硫酸镁、硫酸铵。设置的浓度梯度为 0.3%、0.5%、0.7%、1.0%，调整pH6.0。将混合种子液按接种量10%接入培养基，于30℃，180r/min，摇床培养4d后分别测定生物量和β－胡萝卜素产量。

混合发酵中促进剂的影响:在优化发酵培养基中分别添加柠檬酸三钠和橘子皮干粉浸汁，调整pH6.0。柠檬酸三钠浓度梯度设置为0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%;取橘子皮干粉 10g，加水 50mL，50℃水浴1h后四层纱布过滤，定容至50mL，分别按体积比2%、4%、6%、8%、10%加入优化发酵培养基中。将混合种子液按接种量10%接入培养基，于30℃，180r/min，摇床培养4d后分别测定生物量和β－胡萝卜素产量。

2 结果与分析

2.1 两株红酵母的形态

由图1可知，红酵母菌株RY－01和粘红酵母31229不论在菌落形态和显微形态上，两者差异都很明显，红酵母菌株RY－01菌落较大，色深，菌体呈近圆形;粘红酵母31229菌落较小，色较浅，菌体呈椭圆状。

图1 两株红酵母在PDA培养基上的菌落形态(a)和显微形态(10x40)(b)Fig.1 The colony in PDA culture medium(a)and micrograph morphology(10x40)(b)of two Rhodotorula Strains

2.2 单菌发酵与混合发酵结果

由图2可知，在30℃，180r/min，摇床培养4d后，红酵母RY－－01和混合菌的菌体生物量均高于粘红酵母，分别为24.19g/L和23.56g/L;与单菌发酵相比，混合发酵所得到的β－胡萝卜素产量显著提高，达到 8837.83μg/L。高于 Buzzini利用粘红酵母DBVPG3853与巴德利酵母DBVPG3503混菌发酵所得的类胡萝卜素产量 8.2mg/L［18］。

图2 不同菌种发酵的菌体生物量和β－胡萝卜素产量Fig.2 Biomass and β－carotene production from different strains

2.3 培养时间对混合发酵菌体生物量和β－胡萝卜素产量的影响

由图3可知，培养时间对混合发酵的菌体生物量和β－胡萝卜素含量有很大影响。在30℃，摇床转速为180r/min的条件下培养1d时，用分光光度计检测不到β－胡萝卜素，菌体生物量在第3d时达到最大值，为15.52g/L;菌体中β－胡萝卜素产量则在培养4d时达到最高值，为2081.25μg/L。而到培养5d时，菌体生物量和β－胡萝卜素产量均急剧下降。因β－胡萝卜素是红酵母的次生代谢产物，其含量的积累与菌体生物量的积累并不同步，在时间上有一定的滞后性，主要在菌体生长稳定期产生。

图3 培养时间对生物量和β－胡萝卜素产量的影响Fig.3 Effect of fermentation time on biomass and β－carotene production

2.4 碳源对混合发酵菌体生物量和β－胡萝卜素产量的影响

从图4可以看出，两株红酵母混合发酵的最适碳源为麦芽糖。在30℃，180r/min，摇床培养4d后，以麦芽糖为碳源的培养基中生物量和β－胡萝卜素产量均最高，分别为8.62g/L和1437.50μg/L。在本实验中，为了排除天然物的影响，未使用最佳氮源，同时缺少酵母需要的生长因子，采用合成培养基，故而生物量和β－胡萝卜素产量明显偏低。

图4 碳源对菌体生物量和β－胡萝卜素产量的影响Table 4 Effect of carbon source on biomass and β－carotene production

2.5 氮源对混合发酵菌体生物量和β－胡萝卜素产量的影响

由图5可以明显看出，蛋白胨是两株红酵母混合发酵的最适氮源。在30℃，180r/min，摇床培养4d后，在蛋白胨为氮源的培养基中生物量和β－胡萝卜素产量显著高于其他氮源培养基，达到23.80g/L和5225.0μg/L。而在尿素为氮源的培养基中生物量和β－胡萝卜素产量最低，为4.58g/L和37.50μg/L。

2.6 无机盐对混合发酵菌体生物量和β－胡萝卜素产量的影响

图5 氮源对菌体生物量和β－胡萝卜素产量的影响Fig.5 Effect of nitrogen source on biomass and β－carotene production

从图6－a和图6－b可知，总体而言，无机盐的使用对混合发酵中菌体生物量和β－胡萝卜素产量有一定的影响作用。随着K+浓度的上升，菌体生物量和β－胡萝卜素产量呈现下降的趋势，当硫酸钾为0.3%时最高，为12.07g/L和2703.13μg/L，略高于对照组;随着Mg2+浓度的上升，菌体生物量先增后减，在硫酸镁浓度0.7%时最高，为12.15g/L，而β－胡萝卜素产量在硫酸镁浓度1.0%时达到2734.38μg/L，略高于对照组;NH+4浓度的增加对菌体生物量和β－胡萝卜素产量均有一定的促进作用，但低于对照组。

图6 无机盐对菌体生物量和β－胡萝卜素产量的影响Fig.6 Effect of inorganic salt on biomass and β－carotene production

2.7 促进剂对混合发酵菌体生物量和β－胡萝卜素产量的影响

由图7可知，在30℃，180r/min，摇床培养4d后，柠檬酸三钠浓度为0.4%时菌体生物量达到16.57g/L，随着浓度的升高，菌体生物量的略有递减，趋势不大;与菌体生物量相反，柠檬酸浓度为1.2%时β－胡萝卜素产量达到最大值2643.75μg/L，并且随着浓度的增加，呈现出先增加后减少的趋势。表明柠檬酸浓度为1.2%时对菌体产β－胡萝卜素的量有一定促进作用。由图8可知，橘子皮干粉浸汁为6%时菌体生物量和β－胡萝卜素产量均达到最高，分别为16.57g/L和3868.75μg/L，并且随着浸汁使用量的增加呈现先增后减的趋势。β－胡萝卜素是红酵母生长过程中的次生代谢产物，一些前体物质的使用对红酵母产β－胡萝卜素有一定的促进作用。实验中，对照组的菌体生物量和β－胡萝卜素产量为11.73g/L和2531.25μg/L，柠檬酸三钠和橘皮干粉浸汁对菌体生物量有较强的促进作用，橘皮浸汁对β－胡萝卜素产量的促进作用比柠檬酸三钠效果更明显。

图7 柠檬酸三钠对菌体生物量和β－胡萝卜素产量的影响Fig.7 Effect of trisodium citrate on biomass and β－carotene production

图8 橘皮粉浸汁对菌体生物量和β－胡萝卜素产量的影响Fig.8 Effect of orange peel powder extract on biomass and β－carotene production

3 结论

3.1 粘红酵母和红酵母RY－01混合发酵，在30℃，180r/min，摇床培养4d后，菌体生物量和β－胡萝卜素产量达到23.56g/L和8.8mg/L。比Buzzini利用粘红酵母DBVPG3853与巴德利酵母DBVPG3503混菌发酵所得的类胡萝卜素产量8.2mg/L要高。

3.2 碳源、氮源的选择对混合发酵的菌体生物量和β－胡萝卜素产量有很大影响，实验结果表明，粘红酵母和红酵母RY－01混合发酵的最适碳源是麦芽糖，最适氮源为蛋白胨;K+和Mg2+的使用对混合发酵有一定的促进作用，但效果不显著。与对照组相比，硫酸钾浓度为0.3%时，菌体生物量和β－胡萝卜素产量分别提高了2.8%和6.8%;当硫酸镁浓度0.7%时，菌体生物量提高了3.6%，当浓度为1.0%时β－胡萝卜素产量提高了8.0%。

3.3 β－胡萝卜素是红酵母生长过程中的次生代谢产物，其含量的积累与生物量的积累并不同步，在时间上有一定的滞后性。培养基中添加适量的代谢前体物质，有利于β－胡萝卜素的积累。本实验中，添加6%的橘皮干粉浸汁后，混合发酵的菌体生物量和β－胡萝卜素的比对照组分别提高了41.3%和52.8%。

本实验采用了两种不同红酵母混合发酵，探讨其混合发酵的培养基与培养条件，并考察了柠檬酸三钠和橘皮干粉浸汁两种促进剂对混合发酵中的β－胡萝卜素产量和生物量的影响，为β－胡萝卜素高产菌株的选育和β－胡萝卜素的进一步开发利用提供参考。

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