柴 洁，马存强，周斌星，杨 超，郭 威，任小盈

(云南农业大学龙润普洱茶学院，云南昆明650201)

普洱茶是以地理标志保护范围内的云南大叶种晒青毛茶为原料，并在地理标志保护范围内采用特定的加工工艺制成、具有独特品质特征的茶叶［1］。按其加工工艺及品质特征，普洱茶分为普洱生茶和普洱熟茶两种类型。普洱茶的固态发酵工艺是形成普洱茶“醇、厚、甘、滑”等独特品质的关键工序。茶多酚氧化酶(邻苯二酚氧化还原酶，PPO，E.C.1.10.3.1)是茶树体内的一种重要酶类，它对茶树的生长发育具有积极意义，在茶叶加工中占有极为重要的地位，其活性的高低也是决定茶树品种适制性的一个重要指标［2］。茶叶所有化学成分中，多酚氧化酶与茶多酚有着密切的关系。茶多酚又名茶单宁、茶鞣质，由多种酚类物质组成的羟基酚类化合物，是茶叶的主要呈味物质和生理活性成分。茶多酚是以儿茶素为主体成分，占多酚类物质总量的70%～80%［3］。多酚氧化酶的作用主要是促使儿茶素类物质氧化形成茶黄素、茶红素和其它的氧化聚合物，同时伴随儿茶素的氧化，氨基酸、胡萝卜素等香气前体发生偶联氧化，产生各种各样的香气化合物［4］。近期的研究表明，普洱茶固态发酵过程中，随着翻堆次数的增加，儿茶素总含量显著下降，减幅达70%～90%，特别是酯型儿茶素(ECG、EGCG)的下降趋势很明显。普洱茶固态发酵过程中茶多酚是形成普洱茶品质的重要活性物质，在茶汤中呈苦涩味，有较强的刺激性，与普洱茶品质相关系数为0.875［5］，而多酚氧化酶与茶多酚的变化有密切的联系，因此测定研究普洱茶发酵过程中多酚氧化酶的活性具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

普洱茶原料 临沧凤庆大叶种晒青毛茶(2012年4月)，云南昆明茶叶市场;聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、邻苯二酚、L－脯氨酸、牛蛋白标准液Sigma公司;丙酮、石英砂、尿素、柠檬酸、磷酸氢二钠、酒石酸铁 天津市风船化学试剂科技有限公司;表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表儿茶素(EC)、焦性没食子酸标准品 Sigma公司。

JH752型紫外可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司;HH－S28s型数显恒温水浴锅 金坛市环保仪器厂;SKG－02.500型电热恒温干燥箱 黄石市恒丰医疗器械有限公司;JR－1003电子天平 上海新诺仪器厂;ABW－1001－U艾科浦超纯水机 重庆颐洋企业发展有限公司;KDC－2046低温大容量离心机 中国科学大学科技实业总公司中佳光电仪器公司;MDF－32V低温冰箱 日本三洋SANYO公司;PHS－3型精密PH计 上海雷磁仪器厂;Labonce－250TH恒温恒湿实验箱 北京兰贝石恒温技术有限公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 取3份晒青毛茶茶样，每份5000g，采用 GB/T8304－2002［5］120℃烘干法测定毛茶含水量为5.56%，分别添加1620mL蒸馏水使含水量达38%，充分拌匀茶样，然后将茶样放置在温度为30℃、空气湿度为80%培养箱中发酵，每隔6d翻堆一次，翻堆时取样品测定蛋白质含量、多酚氧化酶活性以及含水量，水分不足38%时要补水。

1.2.2 粗酶液的制备 发酵茶样翻堆时取发酵样0.5g，加不溶性聚乙烯吡咯烷酮0.3g、石英砂2g及适量的预冷的pH5.6柠檬酸磷酸缓冲液，在冰冷的研钵中磨成匀浆，并用上述缓冲液定容至10mL再放置4℃的冰箱浸提12h，并搅拌几次。过滤后放到低温超速离心机中以4000r/min离心15min，上清液即为酶制液［6］。

1.2.3 酶活性反应条件研究

1.2.3.1 最适pH的确定 取酶液1mL，加反应混合液3mL，按柠檬酸－磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)∶0.1% 脯氨酸∶1% 邻苯二酚(10∶2∶3)比例配制成反应液，在 37℃下温浴10min，立即加1mol/L偏磷酸3mL终止反应，反应结束后测定酶活力，3次平行实验，求平均值。

1.2.3.2 最适温度的确定 取酶液1mL，加反应混合液3mL，按0.1mol/L pH5.6柠檬酸－磷酸缓冲液∶0.1%脯氨酸∶1%邻苯二酚(10∶2∶3)比例配制成反应液，分别在30、37、40、45、50、55、60、65、70、75℃条件下加热10min，立即加1mol/L偏磷酸3mL终止反应，反应结束后测定酶活力，3次平行实验，求平均值。

1.2.3.3 最适酶促反应底物 分别配制2mmol/L的EGCG、ECG、EGC、EC 和50mmol/L焦性没食子酸代替1%邻苯二酚作为酶促反应底物。取酶液1mL，加反应混合液 3mL，0.1mol/L pH5.6柠檬酸－磷酸缓冲液∶0.1%脯氨酸∶反应底物分别依照 12∶2∶1、11.5∶2∶1.5、11∶2∶2、10∶2∶3 比例建立不同浓度的反应底物反应液，测定不同反应底物不同浓度下的OD值，每组3次平行实验，求平均值。

1.2.4 分光光度法测定多酚氧化酶活性 取酶液1mL，加反应混合液3mL(反应混合液按0.1mol柠檬酸缓冲液(pH5.6)∶0.1%脯氨酸∶1% 邻苯二酚 =10∶2∶3 配置)。然后在37℃恒温水浴锅中保温10min，立即加1mol/L偏磷酸偏磷酸3mL终止反应。于460nm波长处，用10mm比色皿比色。空白管中反应混合液中的邻苯二酚用缓冲液代替，3次平行实验，求平均值。酶活性以每克样每分钟E460增加0.1为一活性单位。

酶活性(U)=E460/0.1×W×t

式中:W－样品量(g);t－反应时间(min);E460－反应终止时在460nm处的光密度。

1.2.5 考马斯亮蓝法测定酶蛋白含量

1.2.5.1 蛋白质标准曲线制作 利用0.15mol/L NaCl将标准牛蛋白配制成浓度为0.1mg/mL的蛋白溶液。考马斯亮蓝溶液配方:取100mg考马斯亮蓝G－250溶解于50mL，95%乙醇溶液中，再加10mL，85%磷酸，用蒸馏水定容到 1000mL。依次取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL 的 0.1mg/mL 蛋白溶液和 0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4mL 的0.15mol/L NaCl溶液与5mL 考马斯亮蓝G－250溶液，用漩涡混匀器震荡均匀后，在595nm波长处测定吸光度OD值，3次平行实验，求平均值。得回归方程:Y=186.24X－13.142，Y为蛋白质浓度(mg/mL)，X为OD值;相关系数R2=0.9966。

1.2.5.2 蛋白质含量计算 取0.1mL粗酶液用0.15mol/L NaCl稀释10倍。取0.1mL稀释液采取考马斯亮蓝法在595nm波长处测定吸光度OD值，3次平行实验，求平均值。通过回归方程计算粗酶液中蛋白含量。

1.2.5.3 米氏方程 米氏方程表示一个酶促反应的起始速度(V)与底物浓度［S］关系的方程。

V=Vmax［S］/(Km+［S］)

式中:V－反应速率，OD/h;Vmax－最大反应速率，OD/h;［S］－底物浓度，mmol/L;Km－米氏常数，mmol/L。

Km值表示酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。Km值与pH和温度有关，而与酶液浓度无关。当Km最小时，一般称为该酶的最适底物或天然底物。一般通过双倒数法计算Km和Vmax。以底物浓度的倒数为横坐标、以酶反应的初速度倒数为纵坐标，利用Line weaver－Burk双倒数法做图。

1.2.5.4 多酚氧化酶比活力 酶的比活力是指每毫克或每克酶蛋白所具有的酶活力单位。一般用U/mg或U/g表示。

多酚氧化酶的比活力(U/mg)=每毫升酶液的酶活力(U)/每毫升酶液的酶蛋白质量(mg)

2 结果与讨论

2.1 pH对PPO酶活性的影响

不同pH对酶活性的影响如图1所示。从图1中可以看出，pH在4.0～5.5之间PPO活性逐渐增大，在pH5.5酶活性达到最大，而在pH大于5.5时，酶活力急剧下降，pH达到7.5时酶活力已不足最大时的一半。因此，多酚氧化酶酶适宜的最适pH为5.5，茶多酚氧化酶是一类含有铜离子在极端pH环境下变性失活的酶［7］。普洱茶固态发酵期间PPO酶促反应的最适pH为5.5，这与普洱茶固态发酵期间pH维持在5～6的弱酸水平相一致［8］。在碱性环境下会破坏酶蛋白的结构，导致多酚氧化酶迅速失活。

图1 pH对PPO酶活性的影响Fig.1 Effect of pH on activity of PPO

2.2 温度对PPO酶活性的影响

不同温度对该酶促反应的影响如图2所示。从图2中可以看出，茶多酚对温度很敏感，其最适温度为55℃。当温度＜55℃时，酶活性随温度的升高而升高，当温度为55℃时表现最大活力。但是温度＞55℃时，随着温度温度的升高，酶活性直线下降。因此，反应的最适温度为55℃，过高的温度会使酶蛋白变性，破坏了三维结构导致多酚氧化酶的不可逆失活。

图2 温度对酶活性的影响Fig.2 Effect of temperature on activity of PPO

普洱茶固态发酵期间PPO的最适温度为55℃，而有研究表明［7］茶树等植物体内多酚氧化酶最适温度为50℃，两者存在一定差异［9－11］。这应该与固态发酵的高温高湿环境以及微生物的参与有关。普洱茶固态发酵期间，由于微生物热的缘故，叶温持续升高，维持在50℃以上［12］，PPO的本质为蛋白质大分子，只有在保证其活性部位三维结构的完整性前提下，才能发挥其酶促活性。较低的温度影响酶与底物结合的速率，过高的温度破坏酶的活性部位，甚至造成不可逆失活［9］。因此，温度对PPO具有筛选作用。

2.3 不同反应底物对PPO酶活性的影响

多酚氧化酶催化不同底物的反应学符合米氏方程，得到回归方程和相关系数如图3所示。根据直线斜率与截距，求得Km和Vmax，详见表1。

图3 PPO酶反应速率与不同的底物浓度的双倒数曲线Fig.3 Double reciprocal curve of PPO reaction and substrate concentration of distinct substrates

从表1中可以看出，不同反应底物对多酚氧化酶的催化反应有不同的的Km值和Vmax值。Km值是用来表示酶对底物亲和力。从Km值的物理含义可以看出，Km值愈大，则与多酚氧化酶的亲和力愈小。对于同一种酶的多种反应底物时，各底物与酶的Km值则有差异。由此可知，EGC与多酚氧化酶的亲和力﹥EGCG﹥焦性没食子酸﹥EC﹥ECG，但是从反应速率来看是ECG的最大，多酚氧化酶与表儿茶素没食子酸酯(ECG)亲和力较小，这与红茶加工过程中的多酚氧化酶酶促反应底物存在相似性［13］。因此，EGC为多酚氧化酶的最适底物。

表1 不同反应底物下的Km值和VmaxTable 1 The Kmand Vmaxabout distinct substrates of PPO

2.4 普洱茶固态发酵过程中PPO酶活性以及酶液蛋白质含量的变化规律

从图4中可以看出，普洱茶在发酵过程中多酚氧化酶活性呈波浪式上升趋势，在第18d和第36d，出现2个波谷，第48d出堆时活性达到最大值160U。多酚氧化酶的酶蛋白含量前期缓慢下降，中期相对稳定，第36d酶液蛋白质的含量最小为36.3mg/mL，后期有所上升，发酵末期为61.5mg/mL低于发酵初期的76.2mg/mL，因此，酶液蛋白质含量呈现缓慢的下降趋势。

图4 普洱茶固态发酵过程中PPO酶活性和酶液蛋白质含量的变化Fig.4 Variety of PPO activity and protein content during post－fermentation of pu－erh tea

普洱茶固态发酵过程中活性多酚氧化酶活性呈波浪式上升趋势，在第30d和48d出现波峰。其酶活性发酵前期受发酵温度影响，中期与发酵过程中的微生物的种类与含量有关，后期主要可能微生物生长和产生的胞外酶有关［12，14］。

2.5 普洱茶固态发酵期间PPO酶比活力的变化规律

从图5中可以看出，多酚氧化酶的比活力有波浪式上升趋势。在固态发酵初期，多酚氧化酶比活力有小幅度上升，第12d之后，比活力有所下降，第18d多酚氧化酶的比活力为1.41U/mg。多酚氧化酶比活力从18d到30d出现较大幅度的上升，增加幅度为111.35%，之后其比活力有所下降，在发酵末期产生了一个次波峰，多酚氧化酶的比活力为2.58U/mg。

图5 普洱茶固态发酵期间多酚氧化酶比活力的变化Fig.5 Variety of PPO specific activity during post－fermentation of pu－erh tea

普洱茶固态发酵初期，由于酶活性的增长和酶蛋白在微生物的作用下部分降解，多酚氧化酶比活力有小幅度上升。第12d之后，由于酶活力的降幅大于蛋白质的降幅，其比活力有所下降。18d之后随着胞外酶的出现，多酚氧化酶比活力得到进一步提高。在30d之后，由于茶叶自身酶蛋白的降解，其比活力有所下降。发酵后期随着微生物种类趋于稳定，多酚氧化酶比活力也随之处于较稳定的状态。

3 结论

普洱茶固态发酵期间多酚氧化酶酶促反应的最适pH为5.5，最适温度为55℃，最佳酶反应底物为表没食子儿茶素(EGC)。

普洱茶固态发酵过程中多酚氧化酶酶活性呈现波浪式的上升趋势。普洱茶固态发酵过程中酶蛋白含量在发酵前期缓慢下降，中期比较稳定，从第36d到发酵末期有所上升，总体较发酵前期有所下降，但变化比较平稳。普洱茶固态发酵过程中多酚氧化酶的比活力呈波浪式上升趋势，在第30d和第48d时产生两个波峰。

［1］虞富莲 .关于普洱茶种名［J］.茶叶，2003，29(3):163.

［2］黄建安，黄意欢，罗军武，等.茶树多酚氧化酶基因的SNP分析［J］.湖南农业大学学报:自然科学版，2007，33(4):454－458，485.

［3］宛晓春.茶叶生物化学［M］.北京:中国农业出版社，2003:52－53.

［4］曾晓雄，罗泽民.酶在茶叶加工中的应用研究现状与展望［J］.食品工业科技，1993(5):24－27.

［5］梁名志，孙荣琴.普洱茶品质化学研究进展［C］.云南省首届普洱茶国际研讨会论文集.云南科技出社，2004:121－128.

［6］钟萝，等.茶叶品质理化分析［M］.上海:上海科学技术出版社，1989:469－470.

［7］ KapilSharma，ShamsherS Barib，Harsh P Singh.Biotransformation of tea catechins into the aflavins with immobilized polyphenol oxidase［J］.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic2009，56:253－258.

［8］Tian Jun，Shen Fang，Liang Zi Da，et al.Analysis about the chang of total soluble－carbohydrate of pu－erh tea during pilefermentation［J］.Value Engineering，2011(29):313－314.

［9］姜邵通，罗志刚，潘丽军.甘薯中多酚氧化酶活性的测定及褐变控制［J］.食品科学，2001，22(3):19－22.

［10］孔俊豪，孙庆磊，凃云飞，等.多酚氧化酶酶学特性研究及其应用进展［J］.中国野生植物资源，2011，30(4):13－17.

［11］马文锦，刘树兴，凌建刚，等.茭白中多酚氧化酶活性的测定及护色效果研究［J］.食品与发酵工业，2008，24(12):187－190.

［12］黄振兴，赵明星，阮文权，等.普洱茶渥堆过程中微生物对其品质形成的影响及其研究进展［J］.安徽农业科学，2008，36(28):12496－12498，12520.

［13］Youngmok Kim，Kevin L Goodner，Jong－Dae Park，et al.Change in antioxidant phytochemicals and volatile composition of Camelia sinensis by oxidation during tea fermentation［J］.Food Chemistry，2011，129:1331－1342.

［14］张灵枝，程楚镇，李烨.普洱茶渥堆过程主要酶系活性变化研究［J］.食品科学，2010，31(11):1－4.