王 霞，丁继峰，鹿保鑫，张东杰

（1.黑龙江八一农垦大学 食品学院，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江省双鸭山市友谊县食品药品监督管理局，黑龙江 双鸭山 155800）

玉米在我国有广泛的种植面积，是我国的主要粮食作物之一。玉米胚芽是玉米淀粉工业、酒精工业的主要副产物，含有丰富的油脂和蛋白资源。玉米胚芽油营养丰富，富含亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸等人体所必需的脂肪酸，易被人体消化吸收，是一种健康油脂。根据传统的Osborne分离法，玉米胚芽蛋白中的可溶性部分主要包括清蛋白和球蛋白，两者所占比例约为60%、78%，醇溶蛋白很少，仅为2%～5%，谷蛋白的含量差别很大，约6%～23%，玉米胚芽蛋白中的不溶性部分约占12%～20%[1-3]。玉米胚芽蛋白不但含有人体所必需的氨基酸，还含有多种生物活性的氨基酸序列，已经逐渐引起人们的重视，目前已成为研究的热点。

近年来，国内外针对玉米胚芽的研究多数集中在对玉米胚芽油的研究以及玉米胚芽蛋白的提取方面。DICKEY LC等[4]，从玉米胚芽中采用水酶法提取玉米胚芽油，以扩大玉米油的运用范围。皮钰珍等[5]研究了使用酶法提取玉米胚芽蛋白的工艺参数，并通过单因素实验和响应面法确定了提取玉米胚芽蛋白的最佳工艺条件。

通过特异性的蛋白酶水解蛋白质能够获得具有抗氧化活性、ACE-抑制活性、降低胆固醇等功能的生物活性肽。本研究的目的是以玉米胚芽蛋白水解物为原料，考察其在一定浓度条件下对羟自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、Cu2+螯合能力以及对亚油酸过氧化和大豆油氧化的抑制作用，并与VC进行对比，分析玉米胚芽蛋白水解物的抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

玉米胚芽蛋白水解物：实验室自制。邻二氮菲：上海邦成化工有限公司；邻苯三酚：上海邦成化工有限公司；吡啶：天津市康科德科技有限公司；铁氰化钾：南京化学试剂有限公司；硫氰酸铵：南京化学试剂有限公司；抗坏血酸：Sigma公司；碘化钾：天津科密欧化学试剂有限公司；邻苯二酚紫：沈阳市试剂五厂；DPPH：Sigma公司；以上均为分析纯。

1.2 主要仪器

T6新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；DK-S24电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；JJ-1精密定时电动搅拌器：江苏金坛荣华仪器制造有限公司；RE52-98旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；DGG-9053A电热鼓风干燥箱：上海森信实验仪器有限公司；LD4-40低速大容量离心机：北京京立离心机有限公司；AR2140电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）真空泵：巩义市英峪予华仪器厂；TGL-16B高速离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 玉米胚芽蛋白提取的工艺流程

玉米胚芽→脱除脂肪→玉米胚芽蛋白溶液→调节pH 值为9.0 →加温搅拌→3 次离心→提取上清液→调pH 值为6.3 加α-淀粉酶→65℃酶解→调pH 值→2 次离心→沉淀脱盐→蛋白含量测定

1.3.2 羟自由基清除能力

采用邻二氮菲法[6]，略有改动。

取0.5mL 0.75mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液于试管中，取1mL 0.15mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 7.4）和0.5mL去离子水依次加入试管中，充分混匀，加入0.5mL 0.75mmol/L FeSO4溶液后立即混匀，加入0.5mL 0.01%H2O2溶液，将试管置于37℃恒温水浴反应60min，在波长536nm处测定吸光度值，所测得的数据为损伤管的吸光度值A损。未损伤管以0.5mL蒸馏水代替损伤管中0.5mL 0.01%H2O2溶液，操作方法同损伤管，可测得波长536nm处未损伤管的吸光度值A未；样品管以0.5mL待测样品代替损伤管中的0.5mL蒸馏水，操作方法同损伤管，可测得波长536nm处样品管的吸光度值A，按下式计算样品对·OH的清除率：

式中：A损为损伤管的吸光度值；A未为未损伤管的吸光度值。

1.3.3 超氧阴离子自由基清除能力

采用邻苯三酚法[7-8]，略有改动。

取0.1mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.2）2.8mL（其中含有2mmol/L EDTA），加0.1mL不同浓度的待测样液，混和均匀，于25℃恒温水浴中保温10min，然后加入3mmol/L的邻苯三酚0.1mL（25℃水浴预温），立即混匀，在波长325nm处每隔0.5min测定一次OD值，反应4.5min结束。空白为0.1mol/L，Tris-HCl缓冲液（pH 8.2），对照组为等体积去离子水，做吸光度值随时间变化曲线的回归方程，其斜率为邻苯三酚的自氧化速率V，与同浓度的VC溶液做对照，所有测定值均为3次结果的平均值，按下式计算样品对·的清除率：

式中：V对照为以VC 作为对照的回归方程斜率；V 样品为样品的回归方程斜率。

1.3.4 DPPH自由基清除能力

参照ZHANG S B等[9]的测定方法并稍作修改。

取不同浓度的样品溶液2mL加入2mL 1×10-4mol/L DPPH溶液，用2mL 95%vol乙醇溶解1×10-4mol/L DPPH作为对照组，在室温避光条件下反应30min，在波长517nm处测定吸光度值，以乙醇作对照，测定值均为3次测定结果的平均值，DPPH自由基清除率按下式计算：

式中：A样品为样品溶液在波长517nm 处的吸光度值；A对照为以乙醇作为对照在波长517nm 处的吸光度值。

1.3.5 Cu2+螯合能力

参照WANG L L 等[10]的测定方法，略有改动。

向1mL 2×10-4mol/L CuSO4溶液、1mL 10%的吡啶与20μL 10%邻苯二酚紫（PV）混合溶液中添加1mL的玉米胚芽蛋白水解物，用邻苯二酚紫作为金属螯合指示剂，邻苯二酚紫与CuSO4结合形成蓝色物质，在有螯合剂存在时PV与Cu2+分离，溶液蓝色消失。邻苯二酚紫溶液颜色的变化可以在波长632nm处测量。玉米胚芽蛋白水解物对金属Cu2+的螯合作用可按下式计算：

式中：A样品为样品溶液在波长632nm 处的吸光度值；A对照为水溶液在波长632nm 处的吸光度值。

1.3.6 在亚油酸体系中的抗氧化性

采用硫氰酸铁（FTC）法[11]，略有改动。

于10mL试管中加入3.0mL玉米胚芽蛋白水解液和2.0mL 0.05mol/L亚油酸乙醇溶液，置于高速均质机均质，用硅橡胶塞密封，放在60℃恒温培养箱中保温，每24h测定吸光度值。吸光度值的测定：取0.1mL待测液，加入4.7mL 75%vol的乙醇，0.1mL 30%的硫氰酸铵和0.1mL 0.02mol/L的硫酸亚铁（3.5% HCl溶液），混和均匀，5min后于波长500nm处测定吸光度值，每天测定一次，所有测定值均为3次结果的平均值。

1.3.7 POV值

采用Schaal烘箱法[12]，略有改动。

称若干份大豆油30g于烧杯中，加入不同质量的玉米胚芽蛋白水解物，空白样加入75%vol的乙醇，在高速均质机上均质，置于60℃恒温干燥箱中，诱导其氧化，每隔24h搅拌一次，并调整其在恒温干燥箱中的位置，每隔3d测定油样的过氧化值（POV），所有测定值均为3次结果的平均值。采用碘量法测定过氧化值（即POV值）。

1.4 统计分析

本研究中所有数据均以平均值±标准偏差表示。采用Excel（2003）进行数据统计分析。用Excel（2003）软件绘制图示。

2 结果与分析

蛋白多肽的抗氧化活性受很多因素的影响，并且水解物抗氧化作用机制大不相同，如通过清除或络合引发过氧化的引发剂从而起到抗氧化的效果；或通过阻断过氧化链反应，即清除过氧化中间自由基而起到抗氧化作用。除了能在油脂外层形成包膜外，还包含了电子/氢供体、自由基清除及金属离子螯合等其他抗氧化机制。所以单一检测体系往往很难全面反映其抗氧化能力，需采用多种体系来研究其作用效果[13-14]。

2.1 羟自由基清除能力的测定结果

羟自由基（·OH）是一种氧化能力很强的自由基，有研究表明，其几乎能以极高的反应速度和生物体内所有的分子发生反应，如DNA断裂、交联或者突变、蛋白质变性、多糖分解等，可以导致许多病理变化[15]。用于测定·OH的方法有很多种，如邻菲罗琳化学发光法、DMSO-荧光法、水杨酸比色法和邻二氮菲-Fe2+氧化分光光度法等。本研究选用的是邻二氮菲-Fe2+氧化法分光光度法，H2O2/Fe2+体系通过Fenton反应产生羟自由基，在波长536nm处最大吸收峰消失，反应式：

图1 玉米胚芽蛋白水解液对·OH的清除效果Fig.1 Elimination effect of corn germ protein hydrolysates on·OH

由图1可知，玉米胚芽蛋白水解液对·OH的清除率随玉米蛋白水解液浓度的增加呈现上升趋势，清除效果先显著增强后又逐渐减弱。抗氧化剂的作用原理主要是两方面：一方面是与·OH直接发生反应，阻断自由基连锁反应进行；另一方面是螯合Fe3+，从而减少·OH的生成[16]。对于玉米胚芽蛋白水解物来说，可能主要是含有较多的供氢质子或电子，从而使具有高度氧化性的自由基失活，达到终止自由基连锁反应、清除或抑制自由基的目的；同时还可能有利于对金属离子螯合作用的空间结构，从而减少·OH的生成。

2.2 超氧阴离子自由基清除能力测定结果

图2 玉米胚芽蛋白水解液对的清除效果Fig.2 Elimination effect of corn germ protein hydrolysates on

由图2可知，随着玉米胚芽蛋白水解物浓度的增大，玉米胚芽蛋白水解物对清除能力呈逐渐增大趋势，表明其具有较强的氧化性。与VC对清除能力相当。所有生物功能所消耗的能量来源于生物体内脂肪、蛋白质和糖类等物质的氧化作用，超氧阴离子自由基是生物体内自由基产生的根源，能促进脂肪氧化，并且能通过氧化损伤DNA及细胞膜对细胞产生毒性，促进生物体衰老，诱发炎症和肿瘤。邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化反应释放和有色中间产物，此有色产物在波长325nm处有特征吸收峰。当有抑制剂存在时，可清除，从而使邻苯三酚自氧化过程受阻，阻止了中间产物的积累。在本测试中，玉米胚芽蛋白水解物就起到了抑制剂的作用，清除了。

2.3 DPPH·自由基清除能力测定结果

图3 玉米胚芽蛋白水解液对DPPH·的清除效果Fig.3 Elimination effect of corn germ protein hydrolysates on DPPH·

由图3可知，随着玉米胚芽蛋白水解物浓度的升高，DPPH·自由基清除能力呈现了先显著增加而后缓慢降低的趋势，而VC对DPPH·的清除能力变化不大，可能由于玉米胚芽蛋白水解物中同时存在抗氧化成分和促氧化成分，从而使玉米胚芽蛋白水解物对DPPH·的清除能力有所降低。大多数自由基具有活泼的化学性质，而二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）不同于大多数的自由基，是一种稳定的基团，其结构上具有苯环的共扼和位阻及硝基的吸电子作用，其反应程度取决于抗氧化剂的供氢能力，DPPH·在波长517nm处有吸收峰，其溶液呈深紫色。当存在自由基清除剂时，溶液逐渐变为黄色。

2.4 Cu2+螯合能力测定结果

Fe2+、Cu2+等过渡金属离子参与生物体内的多种氧化过程，他们与活性氧自由基的产生有着密切的关系，Fe2+可以催化巯基化合物、儿茶酚胺类化合物自氧化生成和H2O2等。Cu2+可以催化低密度脂蛋白发生氧化作用。由图4可知，玉米胚芽蛋白水解物具有Cu2+螯合能力，并且螯合能力随着玉米胚芽蛋白浓度的增加而呈逐渐上升的趋势，这可能是由于水解液浓度的增加，相应的增加了羧基的含量，从而使Cu2+与羧基的结合能力提高，使得脂质体系中游离的Cu2+逐渐减少。

图4 玉米胚芽蛋白水解液对Cu2+的螯合能力Fig.4 Copper-chelating capacity of corn germ protein hydrolysates

2.5 在亚油酸体系中抗氧化性的测定

图5 不同玉米胚芽蛋白水解液添加量抑制亚油酸氧化的效果Fig.5 Suppressive ability of linoleic oxidation of different concentrations of corn germ protein hydrolysates

通过硫氰酸铵检测方法研究抗氧化剂在防止亚油酸过氧化方面的能力，大量的过氧化脂质将Fe2+氧化生成Fe3+，Fe3+与SCN-结合生成硫氰酸铁，显红色。抗氧化物由于能够清除自由基，从而抑制反应，减少红色硫氰酸铁的生成，根据此原理通过比色反应判断玉米胚芽蛋白水解物的抗氧化性。由图5可知，根据曲线的上升趋势可以看出，在前2d，亚油酸的氧化速率缓慢，而后氧化速率直线上升；添加了玉米胚芽蛋白水解物的反应体系中，亚油酸的氧化速率守到了不同程度的抑制，玉米胚芽蛋白水解物浓度越高，亚油酸氧化速率被抑制的效果越好。说明玉米胚芽蛋白水解物具有提供氢质子的能力，具有抗氧化作用。

2.6 POV值的测定

对玉米胚芽蛋白水解物的POV值进行测定，结果见图6。

图6 不同玉米胚芽蛋白水解液添加量对大豆油抗氧化效果的影响Fig.6 Antioxidant results of different concentration of corn germ protein hydrolysates in soybean oil

油脂的酸败程度一般以油脂的过氧化值（POV值）来衡量，油脂中含有的过氧化物越多，其过氧化值越高，油脂酸败的程度越严重。由图6可知，前6d，各试验组的过氧化值变化并不明显，可能由于此阶段油脂的过氧化物尚未生成，但随着时间的继续延长，过氧化值变化明显，空白组的过氧化值明显高于添加了玉米胚芽蛋白水解物的试验组，而且玉米胚芽蛋白水解物添加量大的，抗氧化的作用也越强，说明玉米胚芽蛋白水解物具有一定的抗氧化活性。但是由于油脂氧化过程中生成的过氧化物是一种中间产物并不稳定，在一定条件下会继续分解，因此在试验后期过氧化测定值有所下降。

3 结论

通过研究玉米胚芽蛋白水解物对羟自由基、超氧自由基和DPPH自由基清除能力，Cu2+螯合能力，防止亚油酸体系和大豆油抗氧化等活性，试验结果表明，玉米胚芽蛋白水解物对羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基具有一定的清除能力，且浓度为6mg/mL时效果最好；对Cu2+具有螯合能力，并且螯合能力随着玉米胚芽蛋白水解物浓度的增加而呈上升趋势；对亚油酸氧化具有降低作用，作用效果与剂量成正相关，同时对油脂的POV值具有降低作用，浓度为0.1%时降低作用最强。

[1]张鸣镝，姚惠源.玉米胚芽蛋白及其在食品工业中的应用[J].食品科技，2006（5）：124-127.

[2]张秋琴，叶义杰.玉米胚芽油的生产现状与发展前景[J].农产品加工，2008（8）：54-56.

[3]李 丽，崔 波，白伟芳.玉米胚芽蛋白的综合利用[J].食品与发酵科技，2010（2）：15-19.

[4]DICKEY LC,JOHNSTON DB,KURANTZ MJ,et al.Modification of aqueous enzymatic oil extraction to increase the yield of corn oil from dry fractionated corn germ[J].Ind Crops Prod,2011,34(1):845-850.

[5]皮钰珍，刘彦妮，岳喜庆，等.酶法提取玉米胚芽蛋白的工艺优化.食品科技，2011，36（7）：157-160.

[6]彭志英.食品酶学导论[M].北京：中国轻工业出版社，2002.

[7]荣建华，李小定，谢笔钧.大豆肽体外抗氧化效果的研究[J].食品科学，2003，11（4）：118-120.

[8]苗志伟，周卫红.超氧化物歧化酶模型化合物的合成，表征和活性测定[J].有机化学，1999（19）：537-541.

[9]ZHANG SB,WANG Z,XU SY.Antioxidant and antithrombotic activities of rapeseed peptides[J].J Am Oil Chem Soc,2008,85:521-527.

[10]WANG LL,XIONG YL.Inhibition of lipid oxidation in cooked beef patties by hydrolyzed potato protein is related to its reducing and radical scavenging ability[J].J Agric Food Chem,2005,53:9186-9192.

[11]CHEN HM,MURAMOTO K,YAMAUCHI F,et al.Antioxidative properties of histidine-containing peptides designed from peptide fragments found in the digests of a soybean protein[J].Agric Food Chem,1998:49-53.

[12]GB/T5009.37-1996 食品卫生检验法[S].

[13]郭红英.麦胚蛋白酶解物的制备及其抗氧化功能研究[D].镇江：江苏大学硕士论文，2009.

[14]马并喜，闵 伟.大豆蛋白酶法水解产物抗氧化活性的研究[J].中国酿，2012，31（10）：135-141.

[15]严群芳.大豆抗氧化肽的分离及其生物活性的研究[D].长沙：湖南农业大学硕士论文，2006.

[16]GORDON MH.The mechanism of the antioxidant action in vitro:Food Antioxidants[M].New York:Elsevier Applied Science,1990:l-18.