刘保魁，杨玉秀，韩双印，张立达，白阳秋，房新辉

肝癌是我国常见的肿瘤之一，起病隐匿，恶性程度高，大部分患者发现时已处于中晚期，因此肝癌的早期诊断至关重要。甲胎蛋白(AFP)是目前临床上应用最广泛的诊断肝癌的肿瘤标志物，但是，仍然有30%～40%的肝癌患者AFP水平在参考范围内[1]。所以，寻求一种新的肿瘤标志物或联合各种肿瘤标志物诊断肝癌成为一种重要策略。硫氧还蛋白(TRX)是一类分布广泛的小分子量多功能蛋白，其含有两个高度保守的半胱氨酸残基活性位点，该活性中心可催化许多氧化还原反应[2]。在生理条件下，TRX参与细胞的生长和增殖、维持细胞内环境稳态、抗氧化应激、调控细胞凋亡等[3]。另外，许多研究表明TRX参与不同肿瘤及其他病变的发生和发展[4]。然而，有关血浆TRX用于诊断肝癌的研究并不多见。本研究应用ELISA法检测TRX在肝癌患者血浆中的表达并评估其诊断肝癌的价值。

1　资料与方法

1.1一般资料选择2012年5—9月河南省人民医院肝胆外科住院的肝癌患者90例(肝癌组)，其中男50例，女40例；年龄32～75岁，平均(50.2±10.5)岁。均经病理检查证实为肝癌，术前均未进行放疗及化疗。临床分期根据国际抗癌联盟的TNM系统分期法划分。选择同期河南省人民医院消化内科肝硬化患者40例(肝硬化组)，其中男25例，女15例；年龄35～70岁，平均(45.0±9.5)岁。选择同期35例同年龄段健康体检者(对照组)，其中男25例，女10例；平均(42.0±7.3)岁。

1.2标本采集抽取清晨空腹静脉血3 ml，置于EDTA抗凝的无菌试管中，室温3 500 r/min离心15 min，收集血浆置于-80 ℃保存待测定。

1.3ELISA检测ELISA试剂盒购自美国RD公司，严格按照试剂盒说明书进行操作。主要检测仪器为BIO-RAD680型酶联免疫检测仪，于450 nm处测吸光度(OD)，读取OD值，然后根据标准品应用Excel 2007(微软公司)软件绘制标准曲线，通过已知标准品水平值计算样品水平值。每1个血浆样品测2次求平均值。

1.4统计学方法采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。因AFP和TRX水平均不符合正态分布，采用中位数(四分位数间距)〔M(QR)〕表示。组间比较采用Mann-Whitney 或Kruskal-Wallis检验，相关分析采用非参数Spearman检验。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析AFP和TRX诊断肝癌的敏感度和特异度。以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1AFP和TRX水平比较肝癌组患者血浆中AFP和TRX水平均高于肝硬化组和对照组，肝硬化组AFP水平高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；肝硬化组TRX水平与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。

表1　3组受检者血浆AFP和TRX水平比较〔M(QR)，μg/L〕

注：与肝癌组比较，*P<0.05；与对照组比较，△P>0.05；与对照组比较，▲P<0.05

2.2肝癌患者AFP和TRX水平的相关性分析将肝癌患者血浆TRX水平与AFP水平进行Spearman相关分析，结果显示TRX水平与AFP水平无直线相关性(r=-0.06,P=0.560)。

2.3肝癌患者血浆TRX与临床特征关系不同年龄、性别、肝炎病毒感染状态、肿瘤大小、肿瘤组织分化程度及TNM分期的肝癌患者血浆中TRX的水平间差异均无统计学意义(P>0.05，见表2)。

2.4TRX和AFP对于诊断肝癌价值的比较ROC曲线分析显示，TRX的ROC曲线下面积为0.840,95%可信区间为(0.775，0.892)。最佳临界值为33.0 μg/L，其敏感度为74.4%，特异度为77.3%。不同临界值TRX的敏感度和特异度见表3。AFP的ROC曲线下面积为0.796，95%可信区间为(0.727，0.855)。最佳临界值为61.0 μg/L,敏感度为56.67%，特异度为80.33%(见图1)。

2.5TRX和AFP联合诊断肝癌的价值90例肝癌患者血浆TRX阳性50例，阳性率55.6%，AFP阳性例数30例，阳性率33.3%；TRX联合AFP检测阳性例数65例，阳性率72.3%。

表2肝癌患者血浆TRX水平与临床特征之间的关系(μg/L)

Table2Relationship between plasma TRX levels with clinical parameters of HCC patients

例数中位数四分位数间距Z(H)值P值年龄(岁)-0 88∗0 376　≤503854 6771 42　>505244 0962 78性别-1 57∗0 116　男性5055 5061 35　女性4043 0577 28肝炎病毒感染状态-0 90∗0 371　乙型肝炎病毒5154 6759 30　丙型肝炎病毒3944 0946 04肿瘤大小(cm)-0 20∗0 837　≤54852 2058 78　>54246 0570 24组织分化程度0 0870 958　高分化3145 0158 22　中分化3446 0565 39　低分化2555 0147 23TNM分期0 3430 754　Ⅰ+Ⅱ3447 5460 54　Ⅲ3244 9558 89　Ⅳ2460 4070 01

注：*为Z值

表3不同临界值TRX对肝癌的诊断价值(%)

Table3Diagnostic values of plasma TRX at different cut-off values determined by ROC curve

临界值(μg/L)敏感度特异度阳性预测值阴性预测值　16 0　91 1148 0067 881 8　33 0　74 4477 3379 871 6120 030 0098 6796 454 0

图1　AFP和TRX诊断肝癌的ROC曲线

Figure1ROC curve of AFP and TRX for diagnosis of hepatocellular carcinoma

3　讨论

肝癌是常见的消化系统肿瘤之一，其发生、发展是一个多因素、多阶段及多基因相互作用的过程[5]。其起病隐匿，恶性程度高，大部分患者发现时已处于中晚期，而且其发病率有逐年上升的趋势。因此肝癌的早期诊断仍是肝癌诊治研究的热点之一。AFP是目前临床上诊断肝癌应用最广泛的肿瘤标志物，但是，其敏感度和特异度不高。寻求新的肿瘤标志物势在必行。

TRX是一种相对分子量为12 kDa的紧密球形蛋白，于1964年首次在大肠埃希菌中被发现，是核糖核酸还原酶的供氢体[6]。TRX氨基序列中含有1个氧化还原活性的Cys-Gly-Pro-Cys氨基酸序列，该活性中心可催化许多氧化还原反应[7]。在生理条件下，TRX参与细胞的生长和增殖、维持细胞内环境稳态、抗氧化应激、调控细胞凋亡等。最近许多研究表明TRX在各种肿瘤患者组织中高表达，如乳腺癌[8]、宫颈癌[9]、胃癌[10]和肝癌[11]等。而许多研究也证明血清TRX可以作为急性胰腺炎[12]、哮喘[13]、腹膜恶性间皮瘤[14]等多种疾病的标志物。尽管已有研究发现血清TRX水平在肝癌患者中增高[15]，但其临床诊断价值并没有深入研究。本研究应用ELISA法检测TRX在肝癌患者血浆中的水平并评估了其诊断肝癌的价值，研究发现，肝癌患者血浆TRX水平明显高于肝硬化组和对照组。这说明TRX在肝癌的发生发展中起着重要作用，并提示血浆TRX可能成为肝癌的肿瘤标志物，这和Yamada等[13]的发现结果一致。研究认为细胞在氧化应激时会向血液中释放TRX[16]；另外也有研究表明在一些癌组织中血清TRX水平增高，但切除癌组织后血清中的TRX水平又会下降[15],这说明肿瘤患者血清中的TRX是由肿瘤组织分泌的。本研究中肝癌患者血浆TRX水平增高可能来源于乙型肝炎或丙型肝炎病毒感染造成的氧化应激和肿瘤组织自身释放所致。

ROC曲线分析表明TRX诊断肝癌的最佳临界值为33.0 μg/L，其敏感度为74.4%，特异度为77.3%。肝癌患者血浆TRX水平与AFP水平无明显直线相关性，这表明AFP阴性肝癌患者可能TRX阳性，两者联合检测可以提高肝癌的诊断率。另外，本研究还发现，肝癌患者血浆TRX水平与性别、年龄、肿瘤大小、肝炎病毒感染情况、肿瘤组织分化程度及TNM分期等无关，具体机制还有待进一步研究。

综上所述，本研究表明血浆TRX蛋白可成为诊断肝癌的新的辅助肿瘤标志物，TRX蛋白和AFP联合检测能提高肝癌的早期诊断率，然而同时也需要大规模的临床试验证明此结论。

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4Arner ES,Holmgren A.The thioredoxin system in cancer [J].Semin Cancer Biol,2006,16(6):420-426.

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13Yamada Y,Nakamura H,Adachi T,et al.Elevated serum levels of thioredoxin in patients with acute exacerbation of asthma[J].Immunol Lett，2003,86(2):199-205.

14Tabata C,Terada T,Tabata R,et al.Serum thioredoxin-1 as a diagnostic marker for malignant peritoneal mesothelioma[J].J Clin Gastroenterol,2013,47(1):e7-e11.

15Miyazaki K,Noda N,Okada S,et al.Elevated serum level of thioredoxin in patients with hepatocellular carcinoma [J].Biotherapy,1998，11(4):277-288.

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