徐晓梅 樊荣 黄晓颖 林乾顶 王良兴

间歇缺氧大鼠NF-kBp65以及MCP-1的表达

徐晓梅 樊荣 黄晓颖 林乾顶 王良兴

目的 探讨间歇缺氧对大鼠血清以及心肌中NF-kBp65以及MCP-1含量的影响。 方法 清洁SD大鼠30只，随机分成3组（每组10只）：正常对照组、间歇缺氧组、持续缺氧组，普通饲料饲养。正常对照组：常压、常氧下饲养；间歇低氧组：每90s一循环，氧舱内低氧浓度维持在6%～8%，持续10s以上；持续低氧组：氧舱内氧浓度维持在8%～11%。每天早上9：00动物入舱，至下午5：00试验结束，每天持续8h，连续35d。然后经右颈动脉抽血，处死大鼠分离其心脏，采用酶联免疫吸附法（ELISA法）测定血清中NF-kBp65以及MCP-1含量，采用免疫印迹法测定大鼠心肌中NF-kBp65以及MCP-1的含量。 结果 与正常对照组相比，在间歇缺氧组以及持续缺氧组中大鼠血清以及心肌中NF-kBp65以及MCP-1的含量明显增加。 结论 间歇缺氧可导致NF-kB的激活，从而导致大鼠血清以及心肌中NF-kBp65以及MCP-1的表达增加。

缺氧 心肌 NF-kBp65 MCP-1 大鼠

Hypoxia Heart muscle NF-kBp65 MCP-1 Rats

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（obstructive sleep apnea hyponea syndrome，OSAHS）以夜间反复发生的上气道阻塞或狭窄而导致的间歇低氧血症为临床特征。研究发现，OSAHS是心血管疾病的独立危险因素。OSAHS似乎与系统性炎症有关[1]，这可能是导致心血管疾病的机制之一，而系统性炎症的中心环节则是核因子-kB（NF-kB）。NF-kB是调节免疫反应、应激反应、凋亡和炎症反应的中心环节。所以NF-kB激活可能是心血管疾病的始动机制。而缺氧可导致NF-kB激活。因此我们推测OSAHS可能通过间歇缺氧导致NF-kB激活，引起系统性炎症反应，进而导致心血管疾病的发病率增加。

本研究模拟OSAHS患者的间歇缺氧状态，测定间歇缺氧大鼠血清以及心肌中NF-kBp65以及单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的含量，以明确缺氧状态下炎症蛋白的表达是否增加，进而导致心血管疾病发病率增加。

1 对象和方法

1.1 对象 由温州医学院动物试验中心提供，共清洁SD雄性大鼠30只，按照体重相匹配随机分为3组，每组10只。喂养均采用相同饲料，由温州医学院动物试验中心统一提供。正常对照组：常压、常氧下饲养；间歇低氧组：每90s一循环，氧舱内低氧浓度维持在6%～8%，持续10s以上；持续低氧组：氧舱内氧浓度维持在8%～11%。每天早上9：00动物入舱，至下午5：00试验结束，每天持续8h，连续35d。

1.2 方法 研究结束后经颈内静脉抽血法处死大鼠快速沿右室壁分离大鼠的左、右心室，称取重量后置入塑料管中置入液氮罐中固定，然后转移至-80°C冰箱中保存。采用酶联免疫吸附法测定血清NF-kBp65、MCP-1含量。采用免疫印迹法测定大鼠心肌中NF-kBp65以及MCP-1的含量。首先收集心肌细胞，预冷的PBS洗涤2次，加入蛋白质抽提试剂轻轻摇动5min，加入裂解液，冰浴下摇动15min进行裂解，14 000g离心15min，采用BCA法进行蛋白定量。蛋白经SDS-PAGE电泳转移至PVDF膜上，膜在5%BSA溶液中室温孵育1h以封闭膜上的非特异结合。TBS/T洗膜3次，每次5min，封闭过的膜加入一级抗体4℃过夜，抗原抗体结合。TBS/T洗膜3次，每次5min，加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体，室温孵育膜1h。TBS/T洗膜3次，每次5min。将膜置于反应液中室温孵育5min。去除过量的溶液，将膜夹在两塑料薄膜之间，以X线胶片曝光。图片扫描保存为电脑文件。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件，计量资料采用表示，采用非参数检验符合正态分布，组间比较采用单因素方差分析，其中两组间比较采用LSD法。

2 结果

2.1 3组大鼠血清中NF-kB以及MCP-1水平的比较 见表1。

表1 3组大鼠血清中NF-kB以及MCP-1水平的比较（ng/L）

由表1可见，与正常对照组比较，间歇缺氧组以及持续缺氧组大鼠血清中NF-kB以及MCP-1水平明显升高，并且差异均有统计学意义（均P＜0.05），而间歇缺氧组以及持续缺氧组相比较，虽然间歇缺氧组比持续缺氧组血清NF-kB以及MCP-1水平表达有所增加，但无统计学意义。

2.2 3组大鼠心肌中NF-kB以及MCP-1的表达电泳图 见图1、2。

图1 3组大鼠心肌NF-kBp65的表达电泳图（N:正常对照组；CH：持续缺氧组；IH：间歇缺氧组）

图2 3组大鼠心肌MCP-1的表达电泳图（注释同图1）

由图1、2可见，在间歇缺氧组以及持续缺氧组中，大鼠心肌NF-kBp65以及MCP-1表达增加，尤以在间歇缺氧组中明显。

3 讨论

OSAHS以夜间反复发生的上气道阻塞或狭窄而导致的间歇低氧血症为临床特征。研究发现，OSAHS是心血管疾病的独立危险因素。OSAHS似乎与系统性炎症有关，这可能是导致心血管疾病的机制之一，而系统性炎症的中心环节则是NF-kB。NF-kB是调节免疫反应、应激反应、凋亡和炎症反应的中心环节[2]。

NF-kB是参与免疫与炎症反应的重要转录因子，能被多种细胞外信号，包括缺氧所激活[3]。NF-kB迅速核移位，进入核内调节多种基因，包括多种细胞因子（TNF-a等）、急性时相蛋白（CRP）、黏附分子如细胞间黏附分子-1和血管内皮黏附分子-1等、趋化因子如单核细胞趋化蛋白-1等的表达，参与炎症反应。

MCP-1属于趋化因子家族中的C-C亚家族成员，单核细胞的趋化主要是由MCP-1来实现的，它能使血液中的单核细胞迁入内膜下，活化为巨噬细胞，吞噬脂质形成泡沫细胞，在动脉粥样硬化（artheroscleros,AS）的早期起着重要作用。同时，在AS发生后期，MCP-1对于促进斑块的不稳定也发挥着作用。MCP-1可由体内多种细胞分泌，包括平滑肌细胞、内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、脂肪细胞等，它能趋化多种炎性细胞向病变部位聚集，并对多种炎症因子的刺激作出应答，从而直接或间接地参与了AS得形成。Martinovic等[4]对263例志愿者研究发现，血清MCP-1水平升高增加了冠状AS的发病风险。

通过本研究发现，间歇缺氧确实可以使血清以及心肌中NF-kB以及MCP-1表达明显增加，这可能是由于缺氧激活NF-kB成活化状态，进而再激活其它炎症因子如MCP-1等，导致系统性炎症反应，从而导致缺氧状态下心血管疾病发病率升高。这可能是OSAHS患者易发生心血管疾病的可能机制之一。

[1]Selmi C,Montano N,Furlan R,et al.Inflammation and oxidative stress in obstructive sleep apnea syndrome[J].Exp Biol Med, 2007,232(11):1409-1413.

[2]Williams A,Scharf S M.Obstructive sleep apnea,cardiovascular disease,and inflammation-is NF-kB the key[J]?Sleep Breath, 2007,11(2):69-76.

[3]Greenberq H,Ye X,Wilson D,et al.Chronic intermittent hypoxia activates nuclear factor-kappa B in cardiovascular tissues in vivo[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,343(2):591-596.

[4]Martinovic I,Abegunewardene N,Seul M,et al.Elevated monocyte chemoattractaut protein-1 serum levels in patients at risk for cOr-onary artery disease[J].Circ J,2005,69(12):1484.

2011-12-12）

（本文编辑：沈昱平）

温州市科技局资助项目（Y20090125）

325000 温州医学院附属第一医院呼吸内科

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the expression of NF-kBp65 and MCP-1 in serum and heart muscle in intermittent hypoxia rats. Methods There are thirty SD rats were randomly assigned into three groups:control group,intermittent hypoxia group and continuing hypoxia group,which were exposed to air,intermittent hypoxia and continuing hypoxia respectively 8h/d for 35d.Then the blood and heart samples were collected,and the NF-kBp65 and MCP-1 levels in serum and in heart tissue were measured with ELISA and Western blot respectively. Results Compared to the control group the contents of NF-kBp65 and MCP-1 in serum and heart were increased both in intermittent hypoxia group and continuing hypoxia group. Conclusion NF-kBp65 and MCP-1 in heart and blood of intermittent hypoxia rats,which may be associated with the activation of NF-kB by hypoxia.