汪小平，王向红,2,†

（1.温州大学物理与电子信息工程学院学院，浙江温州 325035；

2.温州职业技术学院，浙江温州 325035）

亚精胺对诱导DNA凝聚行为的影响研究

汪小平1，王向红1,2,†

（1.温州大学物理与电子信息工程学院学院，浙江温州 325035；

2.温州职业技术学院，浙江温州 325035）

利用原子力显微镜技术（AFM）研究了亚精胺加入次数及不同培养时间对DNA凝聚行为的影响.研究表明，DNA的凝聚行为取决于亚精胺的加入次数和培养时间.随着加入次数的增加，DNA凝聚减慢、凝聚体尺寸变大；随着培养时间的增加，DNA凝聚体变得越来越紧凑.本研究可为DNA凝聚行为的药理特性和生物学效应提供科学依据.

AFM；亚精胺；DNA凝聚；加入次数；培养时间

在特定的时期，活细胞控制着DNA的凝聚和解聚任务，例如在细胞生命周期内遗传密码使得基因得以表达[1-2]，同时长链DNA储存在微米大小的区域内[3].在基因的复制和传递过程中，这种凝聚机制是一种很重要的保护机制，从外部保护了遗传信息的安全性.研究DNA凝聚的详细过程可以帮助我们了解DNA如何被组织染色，以及如何发展成基因运载工具[4].近年来，科学家对DNA凝聚做了大量研究.在体外实验中，Gosule等[6]通过电子显微镜首次观察到在缺少ATP和蛋白质的存在下，正三价的亚精胺可直接诱导DNA凝聚成为环状、棒状的结构.Wilson等[7]通过光散射手段研究了同价态的阳离子，如Na+、Mg2+、正三价的亚精胺和正四价的精胺对DNA凝聚的影响.事实上，多价阳离子[8-10]、酒精[11]、蛋白质[12]、中性的凝聚聚合物[13]和一些抗癌药物[14]都可以诱导DNA凝聚成不同的形态.但是值得注意的是，多价阳离子诱导DNA凝聚过程与生物体内的DNA有序存储过程有着许多共同特征，该凝聚主要取决于多价阳离子的价数，而不是多价阳离子的结构[15].研究还发现，使DNA凝聚的凝聚体的大小除了取决于采用的凝聚剂外，还受阳离子的浓度和添加时间的影响.同时，在不同培养时间[16]，不同浓度下形成的不同形态的十二烷基溴凝聚体，最后可以释放成原始形式[17].

本文利用原子力显微镜技术（AFM）研究了不同亚精胺加入次数和样品不同培养时间对DNA凝聚行为的影响，分析DNA在亚精胺作用下凝聚行为的变化，为亚精胺诱导DNA凝聚行为的药理特性和生物学效应提供依据.

1 材料和方法

1.1 试剂

λ-DNA（DNA浓度为500 ng/μL，储存条件为：100 m mol/L，Tris-HCl，pH 8.0，10 m mol/L NaCl，1 m mol/L EDTA），亚精胺（100 μ mol，C7H19N3•3HCl，Mr 254.6），购自华美生物工程公司（分析纯），纯水（18.2 m•cm）是经过密理博超纯化系统去离子与净化处理.

1.2 DNA凝聚体样品的制备

先分别加120 μL水、1.2 μL DNA到A、B、C、D无菌管中.A管不加亚精胺；B管一次性加入亚精胺60 μL；C管先加亚精胺30 μL，20 min后再加入亚精胺30 μL；D管先加入亚精胺10 μL，然后每隔20 min加10 μL亚精胺，直到加完60 μL亚精胺为止.静置10min.见图1.

图1 不同阳离子加入次数示意图

1.3 AFM观察

分别从A、B、C、D管底部取8 μL溶液，滴加到新鲜解离的云母片表面.约3 min后，用氮气吹干，然后用AFM进行观察.AFM参数：微悬臂长为200 μm，力常数为0.12 N/m，扫描速度一般为3.0 – 5.0 Hz，成像模式为接触式，图像采集为height方式.

2 结果与讨论

2.1 不同阳离子加入次数下DNA凝聚行为

用AFM对凝聚体进行观测时，制样过程快速、简单，仅涉及到DNA吸附到云母基底的快速干燥过程.因此，我们所观测的结果基本上能代表凝聚体在溶液中的固有状态.

图2所示是未添加亚精胺的DNA的AFM图像，从图中可以看出，由溶液的自由状态直接吸附到云母基底的DNA分子呈线性舒展状态.图3所示是在不同的亚精胺阳离子加入次数（垂直）和不同的培养时间（水平）下，用原子力显微镜观察亚精胺诱导的DNA凝聚体图像.由图2和图3的形貌对比我们可以知道，加入亚精胺前后DNA的状态有明显不同，加入亚精胺后DNA由图2的线性舒展形式变为网状或者球状凝聚体形式，这表明亚精胺可以诱导DNA凝聚.

图2 未添加亚精胺的DNA的AFM图

图3表示不同的亚精胺阳离子加入次数与不同的培养时间情况下，亚精胺诱导DNA凝聚的AFM图象（扫描范围为5 μm×5 μm）.从图3可以看出，线性舒展的DNA在亚精胺加入1 min后迅速开始凝聚，说明亚精胺的加入起到了决定作用.当亚精胺（阳离子）的加入次数不同时，凝聚剂与DNA形成的凝聚体在结构和尺寸上表现不同.当亚精胺加入次数为1时，自由伸展的DNA在亚精胺加入的最初1 min内迅速开始凝聚，而且分布比较均匀.当培养时间为15 min时，DNA局部凝聚成网状凝聚结构.当培养时间更长，为60 min时，所有的DNA链全部坍塌成球状结构.当亚精胺加入次数为2时，DNA链在1 min时也快速凝聚，但是DNA凝聚体更紧凑；随着培养时间的增加，DNA链折叠成小片，然后那些微小的小片结合成串状；经过长时间的模拟，为60 min时，所有的DNA分子链凝聚成紧凑的球状结构.当亚精胺加入次数为6时，DNA在亚精胺加入的1 min内凝聚成很紧凑的网状结构，当培养时间为15 min时，紧凑的网状结构开始减小，最后当培养时间达到60 min时，DNA全部凝聚成了尺寸很小但是很紧凑的球状结构.

图3 不同的亚精胺加入次数与不同的培养时间情况下, 亚精胺诱导DNA凝聚的AFM图象

亚精胺的加入次数不同，凝聚过程是不一样的.其中阳离子的加入次数最少（1次）的情况下，DNA自由伸展的时间比较短，DNA凝聚的比较快，亚精胺一加入，DNA链很快凝聚，没有时间弛豫，凝聚体尺寸比较小，最后凝聚成尺寸比较小的网状结构；阳离子的加入次数最多（6次）的情况下，DNA凝聚的比较慢，一边弛豫一边凝聚，凝聚体尺寸比较大，最后导致DNA凝聚成尺寸比较大的球状结构.

2.2 不同培养时间下的DNA凝聚行为

从图3可以看出，当培养时间为1 min时，一次添加亚精胺的DNA快速凝聚成了分布均匀的网状结构；二次添加亚精胺的DNA凝聚体呈网状结构，分布较为均匀；六次添加亚精胺的DNA也凝聚成了网状结构，但凝聚体尺寸却比前面（见图3中a1图和b1图）的大且更紧凑.当培养时间为15 min时，一次添加亚精胺的DNA局部凝聚成了网状结构，二次添加亚精胺的DNA也出现了分布不均匀的凝聚结构，六次添加亚精胺的DNA凝聚体呈现个别比较紧凑的网状机构.当培养时间为60 min时，一次添加亚精胺的DNA全部坍塌成了尺寸很小的球状结构，二次添加亚精胺的DNA坍塌成了球状凝聚体且凝聚体尺寸开始增大，六次添加亚精胺的DNA全部坍塌成了尺寸稍大的球状凝聚体结构.

研究发现，随着培养时间的增加，DNA分子的形态从比较大的紧凑的网状结构变成了较小的高度紧凑的球状结构，凝聚尺寸变小，凝聚体凝聚得越来越紧凑.

3 结 论

本文采用原子力显微镜技术研究了亚精胺诱导DNA凝聚行为的变化特征，得到如下结论：

（1）亚精胺可以诱导DNA凝聚.

（2）当亚精胺一次加入时，DNA凝聚快，凝聚体尺寸比较小且呈现网状结构；随着加入次数的增加，DNA凝聚减慢，凝聚体尺寸变大且呈现球状结构.

（3）随着样品培养时间不同，DNA凝聚体紧凑程度呈现明显差异.

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The Effects of Spermidine on DNA Condensation Behavior

WANG Xiaoping1, WANG Xianghong1,2
（1.School of Physics and Electronic Information, Wenzhou University, Wenzhou, China 325035；
2.Wenzhou Vocational ＆Technical College, Wenzhou, China 325035）

By using atomic force microscopy （AFM）, we systematically studied the effects of spermidine-adding times and culture time on DNA condensation.The research showed that：DNA condensation strongly depends on the spermidine-adding times and culture time.With the adding times increasing, DNA condensates slowly, and DNA condensation becomes bigger；with culture time increasing, DNA condensates fast, and DNA condensation becomes more and more compact.The conclusions of this study can provide the scientific basis for the pharmacological characteristics and biological effects of DNA condensation behavior.

AFM；Spermidine；DNA Condensation；Adding Times；Culture Time

Q-336

A

1674-3563（2013）02-0024-05

10.3875/j.issn.1674-3563.2013.02.005 本文的PDF文件可以从xuebao.wzu.edu.cn获得

（编辑：封毅）

2013-01-09

国家自然科学基金（20774066，20974081，21174131，21104060）；国家自然科学基金重点项目（20934-04）

汪小平（1988- ），女，江西吉安人，硕士研究生，研究方向：高分子物理.† 通讯作者，wangxh@wzu.edu.cn