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(青岛市市立医院血液科，山东 青岛 266071)

微小RNA(miRNA)为一类长度约20～25个核苷酸的内源性小分子非编码单链RNA，主要参与基因转录后水平表达调控[1]，其表达失调在肿瘤的发生和发展中起着关键的作用[2-4]。多发性骨髓瘤(MM)发病率高居血液系统恶性疾病第2位。研究结果显示，miRNA-19在MM细胞中高表达[5-6]。本文检测了43例MM病人及20例正常对照者骨髓单个核细胞(BMMNC)中miRNA-19表达水平，并分析miRNA-19表达与MM预后和临床分期关系，探讨其在MM发生、发展中可能的作用及意义。

1 材料和方法

1.1 材料来源

MM病人骨髓标本均取自我院血液科2006年5月—2011年3月住院的病人，符合张之南主编的《血液病诊断和疗效标准》(1998年)中提出的MM诊断及疗效标准。其中男25例，女18例；年龄为38～78岁，中位年龄55岁。曾分别以MP、VAD、TD和沙利度胺等方案治疗。其中初治25例，难治复发18例。3个疗程化疗后43例中31例有效，无变化和疾病进展共12例。按照Durie-Salmon(D-S)分期标准，Ⅰ期2例，Ⅱ期16例，Ⅲ期25例。β2-MG水平<4.0 mg/L者20例，≥4.0 mg/L者23例。对照组20例，男11例，女9例；年龄39～64岁，中位年龄51岁，均为骨髓常规正常门诊病人。所有入选对象均无自身免疫性疾病及恶性肿瘤等。

1.2 试剂和仪器

Trizol、M-MLV反转录酶(美国Invitrogen公司)，Real-time PCR Master Mix(TOYOBO公司)，LightCyclerTM定量PCR仪(Roche公司)。

1.3 BMMNC的分离

取骨髓5 mL，EDTA抗凝，用生理盐水稀释 3～4倍，然后将其缓慢加至4 mL的Ficoll淋巴细胞分离液中(相对密度1.077)，2 000 r/min离心 16 min。自界面层取得BMMNC，用生理盐水洗涤3次，以2×108/L的密度接种于含体积分数0.15的新生牛血清的RPMI-1640培养液中，置37 ℃、体积分数0.05 CO2和全湿条件下培养。

1.4 总RNA的提取和miRNA-19表达检测

Trizol法提取细胞总RNA，为增加miRNA得率，将异丙醇沉淀步骤改为-20 ℃沉淀2 h以上。定量检测RNA浓度(A260/A280比值>1.8方可用于检测)。加poly(A)尾后，应用M-MLV反转录酶进行逆转录反应，以(Oligo)dT为引物，反应条件如下：16 ℃ 30 min，37 ℃ 30 min，70 ℃ 10 min，4 ℃ 10 min。以此制备的cDNA为模板，以U6作为内参照，在Roche定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR检测，所有样品均做3个复孔，总反应体系为20 μL。设定反应条件为：95 ℃预变性30 s后，95 ℃变性5 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸15 s。按照比较阈值法[7]，读取Ct值，用公式2-ΔΔCt计算目的基因miRNA-19的表达量。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 miRNA-19在MM中的表达

MM组miRNA-19表达水平为6.80±0.87，显著高于对照组，其中复发难治组miRNA-19表达水平为8.49±0.74，初治组为4.35±0.91，两者比较差异有显著性(t=5.82，P<0.05)。

MM病人化疗前miRNA-19表达水平为6.80±0.87，化疗后miRNA-19为3.43±1.57，化疗后较化疗前明显降低(t=2.61，P<0.05)，其中化疗有效组化疗前miRNA-19表达水平为4.97±0.49，化疗后为1.99±0.61，化疗后较化疗前明显降低，差异有显著意义(t=3.83，P<0.05)；无效进展组化疗前mi-RNA-19表达水平为8.06±0.24，与化疗后mi-RNA-19表达水平(6.83±0.57)相比无明显改变。无效进展组化疗前miRNA-19表达水平为8.06±0.24，化疗有效组为4.97±0.49，两组比较差异有显著性(t=5.15，P<0.05)。

2.2 miRNA-19表达水平与β2-MG和D-S分期的相关性

Ⅲ期MM病人miRNA-19表达水平为7.89±1.07，明显高于Ⅱ期MM病人miRNA-19表达水平(4.46±0.43)，差异有显著性(t=3.54，P<0.05)。β2-MG血浆水平≥4.0 mg/L MM的病人miRNA-19的表达水平为7.67±1.29，明显高于β2-MG<4.0 mg/L组miRNA-19表达水平(4.35±0.95)，差异有显著性(t=4.09，P<0.05)。

3 讨 论

MM是一种源发于免疫系统淋巴细胞的恶性肿瘤，其发病率逐年升高，已成为第二常见的恶性血液病，由于异常浆细胞和单克隆免疫球蛋白过度增生，导致严重的体液免疫缺陷和骨骼破坏，MM病死率高[8-9]。目前MM发病机制不清，治疗效果个体差异性大，已有的预后评估指标不能很好地体现病情的复杂性，对其发病机制和预后影响因素的深入研究是有效解决临床治疗难题的关键。

目前普遍认为miRNA与肿瘤细胞的增殖密切相关，miRNA-19在肿瘤发生发展过程中发挥重要的癌基因作用，其过度表达与MM、白血病、淋巴瘤以及乳癌等非血液系统实体肿瘤的增殖、转移和疾病预后密切相关[5-6,10-11]。PICHIORRI等[6]研究结果显示，细胞因子信号传导抑制蛋白1(SOCS-1)是miRNA-19靶基因，过表达的miRNA-19能抑制SOCS-1表达，SOCS-1是IL-6信号传导通路的抑制因子，miRNA-19高表达间接导致肿瘤细胞凋亡受抑制，导致肿瘤细胞侵袭和转移。OLIVE等[12]研究显示，在肿瘤细胞中miRNA-19通过活化Akt-mTOR信号途径，抑制Pten，促进c-myc诱导的肿瘤细胞增殖。LIANG等[13]研究显示，miRNA-19与肿瘤细胞耐药密切相关，而抑制miRNA-19表达能够逆转肿瘤细胞耐药，机制可能与miRNA-19靶向作用Pten有关。

本研究结果显示，MM病人miRNA-19过表达，其中复发难治组miRNA-19表达明显高于初治组，化疗后miRNA-19表达降低，与文献报道结果相符，提示miRNA-19在MM中发挥着重要的致癌基因作用。本研究还显示，化疗后miRNA-19表达降低以化疗有效组最为明显，无效进展组miRNA-19表达化疗前后无明显改变，而且无效进展组病人化疗前miRNA-19表达显著高于同期化疗有效组，提示miRNA-19高水平表达可能为MM病人的不良预后指标，与MM预后有密切关系。本研究还通过比较β2-MG和D-S分期不同组间MM病人miRNA-19表达水平差异，进一步证实了miRNA-19和MM肿瘤细胞的增殖、转移和疾病预后有密切关系，可作为MM预后不良指标，但具体机制有待进一步探讨。

综上所述，miRNA-19通过对靶基因的调控，调节细胞的分化、增殖和凋亡，参与肿瘤细胞的侵袭、浸润和转移，可作为MM预后不良指标之一。利用反义寡核苷酸抑制miRNA-19表达将是MM治疗的一个新研究方向。相信随着基因技术的成功发展，miRNA-19将会成为MM诊断标志物和治疗耐药的新靶点。

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