黄彦钦 沈虹 李墨丹 袁瑛

微卫不稳定(microsatellite instbility，MSI)又称复制错误(replication error，RER)，其意义是肿瘤细胞与同一个体的正常组织细胞DNA相比，肿瘤细胞的基因组DNA中单个、二个、三个或四个核苷酸组成的重复序列长度发生了改变［1-2］。最初的研究认为，MSI是遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC)特征性的分子变化，与人类错配修复基因(mismatch repair，MMR)的种系突变有关。而后续研究发现一小部分的散发性大肠癌也存在着MSI现象，但这种MSI大都与hMLH1基因的启动子区高甲基化状态有关。

目前有两种方法明确肿瘤的MSI状态。一种是RER试验，即设计引物通过PCR的方法扩增微卫星位点，常用的检测位点是美国国家癌症研究所(NCI)专家推荐的5个标准位点(BAT26、BAT25、D2S123、D5S346 和 D17S250)。通过正常组织和肿瘤组织的比较，如果2个以上位点存在MSI状态则认为该患者是高度微卫星不稳定(MSI-high，MSI-H)，即错配修复功能缺陷(defective MMR，dMMR);如果小于2个位点存在MSI状态或无一位点存在MSI状态，则认为该患者是低度微卫星不稳定(MSI-low，MSI-L)或微卫星稳定(microsatellite stability，MSS)，即错配修复功能完整(proficient MMR，pMMR)。除NCI专家推荐的这五个位点，也可扩增Sargent等［3］推荐的11个微卫星位点，如大于30%的位点阳性则患者为MSI-H，如小于30%的位点阳性则患者为MSI-L，所有位点都阴性则患者为MSS。此方法对实验室要求较高，很难在基层医院开展。另一种MSI的检测方法是采用免疫组织化学法(immunohistochemical staining，IHC)检测肿瘤组织中hMLH1、hMSH2、hMSH6和hPMS2蛋白的表达，如这四个蛋白均阳性表达，说明该患者为pMMR状态;如这四个蛋白中任一蛋白为阴性表达，则患者为dMMR状态。此方法相对简单易行，对实验室要求较低，成本也较低，容易在基层医院的病理科开展实施。

美国癌症综合网络(NCCN)的结直肠癌指南中明确指出小于50岁的患者和所有的II期结直肠癌患者在术后选择辅助化疗前，均需明确肿瘤的MSI状态。笔者就从这两个方面对MSI因素在结直肠癌患者中的临床意义做一阐述。

一、检测MSI状态明确小于50岁结直肠癌患者的遗传背景

已有研究表明约三分之一结直肠癌的发生与遗传相关，这其中又以HNPCC最为常见，约占所有结直肠癌的1% ～5%。MSI现象是HNPCC的一个重要特征。错配修复基因遗传性缺陷是HNPCC的病因，而MSI现象正是这些错配修复基因缺陷在基因组上的表现。但是，并不是所有MSI结直肠癌都是HNPCC。有MSI表现的结直肠癌约占所有结直肠癌的15%，而HNPCC只占到其中的3% ～5%，其余的10%～12%是由结直肠癌体细胞hMLH1基因甲基化导致的［4］。同样，并不是有明显家族聚集现象的结直肠癌都会有MSI表现。临床上与HNPCC完全相符的家族聚集性结直肠癌无MSI表现者可达20%以上，这种家族聚集结直肠癌被称作癌家族X综合症［5］。因此，可以说MSI表现与HNPCC是同一原因引起的两种不同表象。

从理论上讲，MSI因素可能包含着HNPCC的发病机制。MMR基因缺陷导致基因组不稳定，DNA在复制过程中错配概率增加，突变积累，最后引发癌症。这是一个看上去比较合理的假设。但是，我们在HNPCC肿瘤组织上发现的MSI状态绝大部分并不在基因的外显子区域，而往往在内含子区或基因之间的区域。1997年NCI专家制定了判定MSI状态的标准，即将 BAT25，BAT26，D5S346，D2S123，D17S150 等 5个微卫星位点作为不稳定程度的标准［6］，有2个及2个以上位点不稳定者为MSI-H，但这些位点并不在基因的重要区域。目前已知的HNPCC相关MSI位点中，体细胞TGFBRII基因上的MSI位点可能与结直肠癌发病机制密切相关［7］，遗传性TGFBRI基因6A微卫星序列可能与结直肠癌易感性相关，但这方面的研究尚未有进一步突破。

MSI和HNPCC均由MMR基因缺陷引起，但不同的MMR基因或不同的MMR基因突变方式引起的结直肠癌似乎并不相同。MMR基因在人类基因组中多达12个，但目前已知与HNPCC的发生有关的仅有4个(hMLH1，hMSH2，hMSH6和hPMS2)。最近，有专家认为一个与hMSH2相关的EPCAM基因突变可能也是HNPCC的致病因素［8］。这些基因遗传性突变的频率和产生肿瘤的类型均有不同，hMSH2和hMLH1占到所有突变的90%以上，其产生的肿瘤大多为结直肠癌，hMSH6突变约占6%，其突变者中子宫内膜癌患病率明显高于其他基因突变者［9］。同样是hMLH1基因变异的结直肠癌，hMLH1启动子甲基化引起者与hMLH1遗传性突变者的结直肠癌生物学特性也存在差异，前者对5-氟尿嘧啶的化疗不敏感，而后者则相对较敏感［10］。在这些MMR基因突变的结直肠癌中，MSI表现则较为一致，BAT25、BAT26等单核苷酸重复序列的不稳定仍然是最常见的MSI现象。

由于几乎所有已证实存在MMR基因突变的HNPCC组织中均存在MSI现象，因此对所有临床确诊的结直肠癌患者检测MSI状态，发现MSI-H者在排除hMLH1甲基化的原因后同时检测患者外周血中MMR基因的遗传性突变，可筛选出HNPCC患者，但单独采用检测MSI状态方法筛选HNPCC患者可能不是一种经济的方法［11］。结直肠癌组织MMR蛋白的IHC检测也有相同的作用［12］，将MSI检测与IHC检测联合应用则有较好的成本效果比［11］。在利用检测MSI状态方法筛选HNPCC的过程中，当筛查发现MSI-H者，还需将遗传突变引起的MSI状态与体细胞hMLH1基因突变引起的MSI状态做鉴别，此时用BRAF基因上V600E突变位点做排除筛选是一个非常有效的方法，因为凡是有BRAF基因突变者均不是HNPCC。应用上述方法对所有结直肠癌患者进行筛查，可发现其中3．6%的患者为 HNPCC［13］。由于 MSI-H结直肠癌的发病年龄较早，椐 Mecklin等［14］的报导，在HNPCC家系表中中，80%的大肠肿瘤发生在50岁以前，12%发生在39岁以下，而1%发生在70岁以上，因此，推荐对发病年龄小于50岁的患者常规进行MSI的检测，以明确其遗传背景。

二、检测MSI状态指导II期结直肠癌患者术后的辅助治疗

对于散发性结直肠癌而言，MSI状态首先是一个预后相关标记。大量回顾性研究的结果提示，无论是在II期患者还是III期结直肠癌患者中，MSI-H的错配修复功能缺陷(dMMR)的结直肠癌患者往往能够获得更好的预后［15-19］。2005年发表在JCO上的一项荟萃分析结果也证实了这一观点［20］。Sargent等［3］对507 例患者进行了 MSI状态检测，发现II期结直肠癌组织分化程度差患者中dMMR比例明显高于其他类型。单因素分析的结果显示，在只接受手术治疗而未行术后辅助化疗的患者中，dMMR(MSI-H)组的无复发生存(disease-free survival，DFS)明显优于pMMR组，这些结果提示MSI状态对患者而言是一项有意义的预后因素。虽然这一结论尚未被多因素分析所证实，但在单因素分析中较高的HR值仍提示其对患者的预后起到了较强的保护作用。研究提示这种保护作用可能与MSI-H状态下肿瘤VEGF表达水平及微血管密度有关［21-22］。

MSI状态除了能够作为结直肠癌患者术后生存的预后因子外，研究还显示MSI状态对5-氟尿嘧啶在结直肠癌患者中的疗效预测上也存在着一定的意义。20世纪90年代起，以5氟尿嘧啶(5-FU)和亚叶酸钙为主的化疗方案成为了III期大肠癌患者以及部分II期高危大肠癌患者的术后标准辅助化疗方案［23-26］。目前，国际上关于III期大肠癌患者常规接受含5-氟尿嘧啶类药物的方案化疗已经达成共识。然而，是否应该对II期大肠癌进行术后常规辅助化疗仍然存在争议。部分临床试验的结果显示，在接受辅助化疗的II期大肠癌患者中只有约3%的患者生存期得到了提高［27-28］，而从已有的研究结果来看，这些患者似乎并未从含5-氟尿嘧啶的化疗方案中获益。也正因为如此，2004年美国临床肿瘤学会提出:不推荐在II期结肠癌患者中进行常规术后辅助化疗。

由于II期大肠癌具有与其他期结直肠癌所不同的临床特征和分子表现(MMR缺失和MSI高发生率)，人们开始关注5-氟尿嘧啶疗效是否与II期大肠癌与众不同的分子特征存在关联性。Ribic等［29］首先提出了dMMR的肿瘤无法从5-氟尿嘧啶化疗中获益的假说。目前许多关于MMR与化疗疗效的研究结果也支持这一观点。一项体外实验的结果显示，hMLH1缺失的细胞系会对5-氟尿嘧啶产生抗药性，这一抗药性通常是由hMLH1启动子甲基化所引起的。实验同时也提示hMLH1缺失状态可以被去甲基物质5氮胞苷所逆转。而另一项异种移植实验也证实了伴MSI现象的大肠癌存在对5-氟尿嘧啶的抗药性［29］。Sargent等对457例结直肠癌患者进行MSI状态检测及随访后发现，无论术后病理分期是II期还是III期，接受5-氟尿嘧啶化疗并不能改善dMMR患者的DFS和OS，尤其对于dMMR的II期大肠癌患者而言，5-氟尿嘧啶辅助化疗反而会降低OS。

由于dMMR结直肠癌患者相对pMMR患者预后相对更佳，因此dMMR患者不接受术后辅助化疗也是一种可选择的治疗策略。美国胃肠协作组正在进行的E5202试验，将II期结直肠癌患者按照手术前MSI状态以及染色体18q的杂合性缺失情况分为高风险组和低风险组进行辅助化疗或观察随访，这个研究结果将进一步明确MSI及18qLOH对II期肠癌预后的影响［30］。而由于dMMR或MSI-H状态的II期结直肠癌并不能够从5-FU的术后化疗中获益，因此不推荐对这些患者进行5-FU的术后化疗，这样也可以避免治疗相关的毒性、花费以及化疗所引起的生活质量的下降。值得注意的是，虽然在Sargent等人的研究中提示pMMR状态的II期结直肠癌患者在接受了5-氟尿嘧啶化疗后在DFS和OS上均有获益，但现有的证据并不支持将pMMR作为II期患者术后辅助化疗的高危因素。目前公认的临床高危因素仍是肿瘤分期为T4、穿孔、肠梗阻、肿瘤分化程度差、存在血管浸润及清扫淋巴结数目小于12枚［31］。

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