张其安 申丽霞 卢德梅 杨少波

（1. 山东华康蜂业有限公司，日照 276500；2. 山东莒县人民医院，日照 276826）

1994年，Ash等（1994）在分子生物学研究结果的基础上将11个种从芽孢杆菌属中分离出来另立类芽孢杆菌属，并将多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）立为类芽孢杆菌属的模式菌种[1]。大量的研究表明，类芽孢杆菌属的某些细菌具有显著的生防潜力，同时类芽孢杆菌还具有生长快、营养简单、可生成具抗逆能力的芽孢等特点[2]。近几年来，国内外有关类芽孢杆菌应用与动植物疾病生物防治的报道日益增多。

欧洲幼虫腐臭病简称欧幼病，是蜜蜂幼虫的一种细菌性消化道传染病，在世界各地均有发生，具有传播迅速、发病快的特点，中蜂（Apis cerana Cerana Fabricius）比意蜂（Apis mellifera ligustica Spinola）更容易受感染[3]。欧洲幼虫腐臭病是由多种致病菌共同作用而引起的，但其主要病原是蜂房蜜蜂球菌（Melissococcus pluton）[4]。蜂房蜜蜂球菌是一种革兰氏阳性菌，但有染色特性不稳定，有时候可能为革兰氏阴性菌，兼性厌氧[5-6]。蜂房蜜蜂球菌抵御不良环境的能力极强，能在蜂尸上存活数年，在粉蜜里也能保持长久的毒性，所以欧洲幼虫腐臭病是一种传染性极强的蜜蜂传染病。蜜蜂欧洲幼虫腐臭病的防治方面的研究始于20世纪初，早期主要是以施用四环素、磺胺类抗生素为主[7]。随着人们对无公害和绿色食品要求的与日俱增，蜂产品中多种抗生素残留的检测已经成为许多国家蜂产品质量检测的必检项目，美国、欧盟、日本等国家已禁止含有多种抗生素残留的蜂产品进入本国，这对我国蜜蜂欧洲幼虫腐臭病的防治工作又提出了新的要求[8]。Paenibacillus brasilensis HK-1由本实验室从蜂场土壤中分离获得，该菌株对蜂房蜜蜂球菌、蜂房哈夫尼菌、幼虫芽孢杆菌、蜜蜂球囊菌等常见的蜜蜂细菌病病原物具有较强的拮抗作用，且发酵性状优良[9]。本试验研究了大孔吸附树脂对Paenibacillus brasilensis HK-1菌株抗菌物质的提取，为该菌株及其抗菌物质在蜜蜂细菌疾病防治方面的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

拮抗菌：Paenibacillus brasilensis HK-1由本实验室分离鉴定

抗菌物质效价指示菌：蜂房蜜蜂球菌（Melissococcus pluton）由本实验室保存。

1.1.2 大孔吸附树脂

AB-8、X-5、D3520、D4020、H103、Nka-9由南开大学提供。

1.1.3 培养基

菌株活化培养基：土豆 200g，牛肉膏 5.0g，葡萄糖 20g，琼脂 15g，（NH4）2SO41.0g，MgSO41.0g，KH2PO40.6g， CaCO33.0g，蒸馏水1000mL。

菌株发酵培养基：土豆 200g，牛肉膏 5.0g，葡萄糖 20g，（NH4）2SO41.0g，MgSO41.0g，KH2PO40.6g，CaCO33.0g，蒸馏水 1000mL。

发酵液效价生物测定培养基：底层培养基：琼脂 18 g，蒸馏水1000mL；上层培养基：NaCl 10g，蛋白胨 10g，酵母浸膏 5g，琼脂 15g，蒸馏水1000mL，pH 6.8。

1.2 方法

1.2.1 抗菌物质效价的测定

生物检测平板的制备：采用双层平板法。底层：在直径为90mm的无菌平皿中加入15mL融化的发酵液效价生物测定培养基。上层：取灭菌冷却到50℃~55℃的上层培养基，加入3%的蜂房蜜蜂球菌菌悬液，按照10mL/皿加入培养皿中；冷凝后备用。

效价测定：采用牛津杯法[10]。在每个平板上以等距离均匀放置牛津杯（内径6mm±0.1mm，高10mm±0.1mm，外径8mm±0.1mm）4个。向每个杯中准确加入250μL不同浓度的抗菌物质溶液，每个浓度设3个重复。37℃培养18 h后用游标卡尺测量抑菌圈直径。

1.2.2 抗菌物质的发酵

发酵培养基经121℃高压灭菌20min，以2%的接种量将种子液接种到250mL三角瓶中。200r/min，28℃震荡培养48h。发酵液100℃灭菌10min，4200r/min离心30min，取上清液备用。

1.3 大孔吸附树脂提取HK-1菌株产生的抗菌物质

1.3.1 大孔吸附树脂吸附性能比较

取1.1.2节中处理好的大孔吸附树脂1g/份，分别加入1.2.2节中HK-1菌株发酵液上清液10mL，150r/min震荡吸附4h，测定发酵液原液、吸附残液效价，计算大孔吸附树脂对HK-1菌株抗细菌物质的吸附率。每个处理2个重复。

1.3.2 大孔吸附树脂解吸性能比较

取1.3.1节中筛选出的吸附性能优良的大孔吸附树脂1g/份，分别加入1.2.2节中HK-1菌株发酵液上清液10mL，150r/min振荡吸附4h。然后分别用50%、75%的乙醇、甲醇和丙酮解吸剂，150r/min振荡静态解吸4h。测定发酵原液、解吸液、吸附残液的效价，计算解吸率，比较各种大孔吸附树脂的解吸性能。每个处理设置2个重复。

1.3.3 丙酮浓度对解吸效果的影响

以体积分数为25%、50%、75%、90%的丙酮溶液为解吸剂，分别对吸附后的树脂静态解吸。测定发酵原液、解吸液、吸附残液的效价，计算解吸率，比较不同浓度丙酮溶液的解吸效果。每个处理设置2个重复。

1.3.4 X-5树脂饱和吸附量的测定

取筛选到的X-5树脂1g/份，分别加入HK-1抗菌物质粗物（发酵液上清经以上筛选到的最佳吸附树脂、解吸液吸附、解吸后，解吸液经浓缩、冷冻干燥所得固体粉末为抗菌物质粗物）5g/L的溶液5mL、10mL、20mL、30mL、40mL，150r/min振荡吸附4h。测定抗菌物质粗物溶液、吸附残液的效价，计算树脂的吸附量。每个处理设置2个重复。

1.3.7 90%丙酮溶液动态解吸曲线及动态解吸率的测定

X-5树脂：提取液1：10（m/V），150r/min振荡吸附4h。弃去上清液，树脂用去离子水冲洗3次后装入直径16mm，柱长400mm的层析柱，先用3倍柱体积的30%丙酮溶液洗脱。然后用90%的丙酮溶液对进行动态解吸。流速为1mL/min，用自动部分收集器分管收集解吸液，每10min收集一管，每管10mL，测定发酵原液、吸附残液以及每管解吸液的效价，绘制解吸曲线并计算动态解吸率。

1.4 HK-2菌株抗菌物质的部分理化性质

1.4.1 对热的稳定性

配制抗菌物质粗物溶液（5g/L），分别于50℃、70℃、100℃水浴中处理10min、20min、40min、60min、80min、100min，牛津杯法测定其效价，比较抗菌物质的效价变化。

1.4.2 抗菌物质对酸碱的稳定性

抗菌物质粗物分别溶于pH为1.2、2.4、3.1、4.9、6.8、10.3和12.4的缓冲液溶液，室温静置12h，比较抗菌物质效价变化。

1.4.3 对紫外线的稳定性

抗菌物质粗物水溶液置于紫外灯下40cm，分别辐照2h、4h、6h和8h，比较抗菌物质效价变化。

2 结果与分析

2.1 牛津杯法测定效价工作曲线的建立

以抗细菌活性物质浓度的对数值为横坐标，以抑菌圈直径为纵坐标制作的标准曲线如图1所示。可见，浓度的对数值与抑菌圈直径呈线性关系，其决定系数R2＝0.9935，可以满足效价测定的要求。由此，可得到发酵液效价计算方程：Y=10（x+4.0913）/6.0594×n〔Y：发酵液效价（μg/mL）；x：抑菌圈直径（12.3mm

图1 牛津杯法测定效价工作曲线

2.2 大孔吸附树脂吸附性能的比较

各种大孔吸附树脂对HK-1抗菌物质的吸附效果如图2所示。可以看出，大孔吸附树脂X-5、AB-8、Nka-9对抗菌物质吸附率达90%以上，其它几种树脂吸附性能较差。选择X-5、AB-8、Nka-9树脂继续考察其解吸性能。

图2 大孔吸附树脂吸附性能比较

2.3 大孔吸附树脂解吸性能比较

分别采用不同有机溶剂作为解吸剂对抗菌物质进行解吸。由图3可以看出，同一种有机溶剂，浓度高的有机溶剂解吸效果优于浓度低的有机溶剂；不同有机溶剂以75%的丙酮解吸效果最好。4种树脂以X-5解吸效果最好，其静态解吸率达68%。因此，选择X-5为HK-1抗菌物质的最佳吸附树脂，进一步筛选最佳解吸剂的浓度。

图3 大孔吸附树脂解吸性能比较

2.4 丙酮浓度对解吸效果的影响

已筛选到的X-5树脂为抗菌物质的吸附树脂，考察不同浓度丙酮对抗菌物质的解吸效果。结果如图4所示，丙酮浓度在40%～80%范围内解吸率逐渐升高，80%的丙酮解吸率最高，解吸率为73%。

图4 丙酮浓度对解吸率的影响

2.5 X-5树脂饱和吸附量的测定

以抗菌物质粗物的质量为横坐标，吸附率为纵坐标，绘制X-5树脂的吸附曲线，结果见图5。可以看出，随着抗菌物质粗物质量的增加，吸附率逐渐降低，1g树脂加入6mg抗菌物质粗物时吸附率可达97.5%。试验选取吸附率为97.5%时树脂吸附的抗菌物质的质量为吸附量。经测定X-5树脂的饱和吸附量为5.85mg/g。

图5 X-5树脂对抗菌物质的吸附量

2.6 80%丙酮动态解吸曲线

以80%丙酮HK-1抗菌物质进行动态解吸。解吸曲线如图6所示，解吸液中抗菌物质浓度较为集中，解吸效果较好，经计算各管的解吸率，结果总解析率为95.3%。这一结果说明，试验筛选的树脂和解吸剂均比较理想。

3 讨论

图6 X-5树脂的动态解吸曲线

利用微生物活体防治蜜蜂欧洲幼虫腐臭病不仅有对其释放风险的担忧，也受释放技术及环境温度、湿度等诸多因素的限制，所以研究者更期望从拮抗菌种提取活性物质用于生物防治[11]。树脂法提取活性物质具有设备简单、操作方便、生产周期短、能耗和成本低、无需添加辅料等优点，利于工业化扩大生产[12]。本研究采用大孔吸附树脂X-5提取Paenibacillus brasilensis HK-1菌株发酵产生的抗菌物质，为该抗菌物质的纯化及其在蜜蜂欧洲幼虫腐臭病防治方面的应用提供了理论参考。

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