曹联飞 苏晓玲 赵东绪 华启云 胡福良

（1，浙江省农业科学院 畜牧兽医研究所，杭州 310021；2，金华市农业科学研究院，金华 321000；3，浙江大学动物科学学院，杭州 310058）

浙江是中华蜜蜂（Apis cerana cerana，中蜂）的传统饲养区，20世纪80年代调查约有10万群[1]。然而随着西方蜜蜂（Apis mellifera）的大量引进，浙江中蜂数量锐减。近几年，中蜂养殖效益大幅提高，中蜂授粉也逐渐兴起，浙江中蜂饲养数量逐渐增加。为了解种群数量波动造成的遗传多样性变化，本研究对浙江中蜂微卫星遗传多样性进行了初步分析。

1 材料与方法

1.1 实验材料

浙江中蜂样本采自浙江省杭州、金华、宁波、绍兴、湖州、衢州、温州、台州、丽水、舟山等地区。其中金华3个采样点，其它地区各1个采样点。每个采样点5群，共计60群。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA提取

取酒精浸泡保存的蜜蜂样本，每群取1只，剪取蜜蜂胸部，按照细胞/组织基因组DNA提取试剂盒的说明和步骤提取总DNA。

1.2.2 微卫星标记的选择

参考NCBI网站及Solignac等[2]报道的微卫星信息，选用A14、A88、A76、A24和B124共5个微卫星位点。反向引物使用FAM或者HEX荧光标记。引物序列及PCR反应退火温度、Mg2+浓度见表1。

1.2.3 PCR扩增

PCR反应体系为10μL，其中10×buffer 1μL，25mmol/L MgCl20.48~0.68μL，10mmol/L dNTP 1μL，10nmol/L引物各0.4μL，DNA模板1μL，Taq酶0.1μL，纯水补齐。PCR反应程序为：94℃ 4min；94℃ 0.5min，55~58℃ 0.5min，72℃0.5min，35个循环；72℃ 10min。

1.2.4 微卫星检测

各个微卫星位点的PCR产物送上海生工生物工程有限公司，由ABI 3730XL测序仪分析。

1.2.5 数据分析

使用GeneMarker软件读取微卫星位点信息。

利用Microsatellite-Toolkit软件[3]计算各微卫星位点的等位基因数目、多态信息含量（PIC）、期望杂合度（He） 和观察杂合度（Ho）。

2 结果与分析

浙江中蜂微卫星遗传多样性指标见表2。

表2 浙江中蜂微卫星遗传多样性指标

浙江中蜂在A14、A24、A76、A88、B124位点分别检测到2、3、5、2、9个等位基因，共检测到21个等位基因，平均每个微卫星位点4.2个等位基因。B124位点的PIC最高，为高度多态位点；A24和A76位点PIC在0.25以上，为中度多态位点。He的变化趋势与PIC一致，B124位点最高，A24和A76位点中等。

浙江中蜂平均期望杂合度为0.3179，平均多态信息含量为0.2835，平均观察杂合度为0.2667。

3 讨论

多态信息含量是衡量基因变异程度较好的指标，当PIC>0.5时，该座位为高度多态性座位；0.25

基因杂合度也称为基因多样度，一般认为它是衡量群体遗传变异的一个最适参数。朱翔杰等[5]研究显示福建中华蜜蜂大部分地区的平均期望杂合度为0.5171。吉挺等[6]研究显示江苏中华蜜蜂群体的平均期望杂合度为0.4424。本研究显示浙江中华蜜蜂平均期望杂合度仅为0.3179，远低于福建和江苏中华蜜蜂。说明浙江中华蜜蜂的遗传多样性较低，有必要对其采取更有效的保护措施。然而本研究的样本数量较少，还有待于进一步系统深入研究。

近年来，利用微卫星标记进行中华蜜蜂的遗传多样性研究逐渐增多，然而已有研究利用的均是西方蜜蜂中报道的微卫星引物，某些引物在中华蜜蜂中多态信息含量较少，影响了研究结果的可靠性。因此，开发中华蜜蜂自身的微卫星标记及引物势在必行。此外，在不同的研究中，微卫星引物使用的统一性也有待解决，以便于未来有关数据的比较分析。

[1] 许少玉, 杨冠煌. 中蜂的分布和变异(三)—粤、闽、浙三省中蜂状况[J]. 中国养蜂. 1982, 33(6): 13~14.

[2] Solignac M, Vautrin D, Loiseau A, et al. Five hundred and fifty microsatellite markers for the study of the honeybee(Apis mellifera L)genome[J]. Molecular Ecology Notes, 2003, 3: 307~311.

[3] Park SDE. Trypanotolerance in West African Cattle and the Population Genetic Effects of Selection[D]. University of Dublin,2001.

[4] Botstein D, White R, Skolnick M. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J].American Journal of Human Genetics, 1980, 32: 314~331.

[5] 朱翔杰, 周冰峰, 吴显达, 等. 福建中华蜜蜂微卫星标记的遗传多样性分析[J]. 福建农林大学学报(自然科学版). 2011, 40(7):407~411.

[6] 吉挺, 陈晶, 殷灵, 等. 江苏省野生及家养中华蜜蜂微卫星DNA遗传多样性分析[J]. 中国畜牧兽医. 2007, 34(12): 39~41.