郭小芬，李红雨，忽 平，张宏岩，高玉霞，贾冬丽

郑州大学第三附属医院妇产科 郑州450052

#通讯作者，女，1964年9月生，博士，主任医师，研究方向:妇科肿瘤，E-mail:tjlhylucky@yahoo.com.cn

卵巢上皮性癌死亡率较高，严重威胁女性生命健康。近年来，随着对肿瘤甲基化状态研究的深入，越来越多抑癌基因的甲基化被认为与肿瘤的发生发展有关［1-2］。在人的腺癌细胞中，TGFBI 被认为是转化生长因子β 诱导的基因，具有抑制肿瘤生长的作用，且有研究［3］表明肿瘤细胞系中TGFBI 基因沉默与其启动子区域CpG 岛甲基化高度相关。血管内皮生长因子(VEGF)及其受体是目前发现的最关键的促血管生长因子之一，它是肿瘤细胞自分泌的重要调节因子，参与调节肿瘤细胞的增殖和诱导血管生成，与肿瘤的生长、浸润和转移能力密切相关［4-5］。作者检测了正常卵巢组织、卵巢良性上皮性肿瘤组织和卵巢上皮性癌组织中TGFBI 基因启动子甲基化状态及VEGF 蛋白的表达，探讨卵巢上皮性癌组织中二者的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 标本来源:郑州大学第三附属医院妇产科2008年8月至2011年3月的石蜡标本共计70例，患者术前均未接受放疗和(或)化疗，且均经病理学证实。患者年龄18～70 岁，其中正常卵巢组织20例(因子宫病变而行附件切除)，卵巢良性上皮性肿瘤组织20例，卵巢上皮性癌组织30例。主要试剂:甲基化专一性PCR 盒购自北京天恩泽基因科技有限公司;甲基化特异性PCR 引物(表1)由郑州宝科生物技术有限公司设计和合成; VEGF 抗体及DAB 显色试剂盒购自北京博奥森公司;SP 免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

表1 甲基化分析所用引物序列及扩增产物大小

1.2 甲基化特异性PCR 采用氯仿-异戊醇法提取组织DNA;然后经过DNA 的亚硫酸盐修饰，操作步骤按照甲基化专一性PCR 试剂盒说明书。PCR反应体系:经修饰后的DNA 2 μL，M(或U)上、下游引物各1 μL，10× BufferⅡ5 μL，dNTPs 4 μL，Taq DNA 聚合酶1 μL，加水至50 μL。PCR 反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，35 个循环; 最后72℃延伸2 min。反应结束后取5 μL 产物进行20 g/L 琼脂糖凝胶电泳，应用凝胶成像分析系统分析电泳结果。实验中出现非甲基化条带且无甲基条带的判定为非甲基化;出现甲基化条带而无非甲基化条带的判定为甲基化;同时出现甲基化和非甲基化条带的判定为半甲基化。甲基化和半甲基化都认为是发生了甲基化。

1.3 VEGF 蛋白表达的免疫组化检测 石蜡包埋组织3 μm 厚连续切片，二甲苯常规脱蜡，具体按SP 试剂盒步骤进行。VEGF 抗体按1 ∶ 100 稀释，滴加一抗4℃过夜，滴加二抗孵育30 min，DAB 显色，中性树胶封片。结果判定:以胞质中含有棕黄色颗粒的肿瘤细胞或血管内皮细胞计为阳性细胞。参照Siddiqui 等［5］的评判标准，高倍镜下，每张切片选择5 个视野，计数200 个细胞，利用阳性区平均灰度即积分光密度计算每张切片阳性细胞百分率，＜10%判定为阴性，≥10%为阳性。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0 处理数据。3 种组织中TGFBI 基因启动子甲基化率和VEGF 蛋白阳性表达率的比较应用χ2检验;卵巢上皮性癌组织中上述2 指标关联性的检验应用Pearson 列联系数分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3 种组织中TGFBI 基因启动子的甲基化 见图1、表1。

图1 3 种卵巢组织中TGFBI 基因的甲基化状态

表1 3 种卵巢组织中TGFBI 基因的甲基化率比较

2.2 3 种组织中VEGF 蛋白的表达 见图2、表2。

图2 3组卵巢组织中VEGF 蛋白的表达(SP，×400)

2.3 卵巢上皮性癌组织中TGFBI 基因启动子甲基 化状态和VEGF 蛋白表达的关联性分析 见表3。

表2 3 种卵巢组织中VEGF 蛋白的表达

表3 卵巢上皮性癌组织中TGFBI基因启动子甲基化状态和VEGF 蛋白表达的关联性分析

3 讨论

DNA 甲基化是目前肿瘤研究中的一个重要方向。抑癌基因启动子区CpG 岛的甲基化将直接或间接抑制该基因的转录，导致下游基因的表达沉默。近年来研究［6］证实卵巢上皮性癌的发生与抑癌基因的异常甲基化密切相关。

TGFBI 是一种抑癌基因［7］。有研究［8］认为:TGFBI 基因甲基化与卵巢癌的发生密切相关，TGFBI 基因发生的甲基化可以作为鉴别恶性与良性肿瘤的新的标记物，其在正常细胞高表达，而在肿瘤细胞表达下调或缺失，这也往往是肿瘤发生的重要因素。有文献［9］表明，在卵巢癌、肺癌和前列腺癌中TGFBI 基因的沉默都与自身甲基化有关。该研究结果显示，TGFBI 基因启动子在正常卵巢组织不发生甲基化，在卵巢良性上皮性肿瘤组织中发生很弱的甲基化，而在卵巢上皮性癌组织中发生了超甲基化，TGFBI 基因甲基化率在卵巢上皮性癌组织中明显高于正常卵巢组织及卵巢良性上皮性肿瘤组织，表明TGFBI 基因启动子在卵巢上皮性癌中发生的甲基化可能导致TGFBI 基因抑癌功能的减弱或丧失，从而促进卵巢上皮性癌的发生发展。

VEGF 定位于染色体6p21.3 上，它可与肿瘤细胞表面的VEGF 受体特异性地结合，通过降解血管内皮细胞基质和削弱血管的屏障作用，使新生血管的基底膜缺损加重，通过渗透作用，促进大量癌细胞进入血液循环，从而在多种肿瘤的血管生成、浸润及转移等过程中起关键作用［10］。该研究结果显示VEGF 蛋白主要在胞质着色; 卵巢上皮性癌组织中VEGF 的阳性表达率明显高于卵巢良性上皮性肿瘤，卵巢良性上皮性肿瘤组织中的VEGF 阳性表达率高于正常卵巢组织，提示VEGF 蛋白在卵巢上皮性癌中呈高表达，这种高表达可能与卵巢上皮性癌的血管生成有关。

此外，该研究结果还显示，卵巢上皮性癌组织中TGFBI 基因启动子的甲基化与VEGF 蛋白的表达有关联，提示TGFBI 基因启动子甲基化可能通过上调VEGF 蛋白的表达，促进新生血管生成，进而参与卵巢上皮性癌的发展。

总之，TGFBI 基因启动子发生的超甲基化可能导致卵巢上皮性癌的发生; TGFBI 基因启动子超甲基化可能与血管生成关系密切，为卵巢上皮性癌的临床诊治提供了一个新的思路和方向。

［1］Supic G，Kozomara R，Jovic N，et al.Prognostic significance of tumor-related genes hypermethylation detected in cancer-free surgical margins of oral squamous cell carcinomas［J］.Oral Oncol，2011，47(8):702

［2］Bell A，Bell D，Weber RS，et al.CpG island methylation profiling in human salivary gland adenoid cystic carcinoma［J］.Cancer，2011，117(13):2898

［3］Shah JN，Shao G，Hei TK，et al.Methylation screening of the TGFBI promoter in human lung and prostate cancer by methylation-specific PCR［J］.BMC Cancer，2008，8:284

［4］Diniz Bizzo SM，Meira DD，Lima JM，et al.Peritoneal VEGF burden as a predictor of cytoreductive surgery outcome in women with epithelial ovarian cancer［J］.Int J Gynaecol Obstet，2010，109(2):113

［5］Siddiqui GK，Maclean AB，Elmasry K，et al.Immunohistochemical expression of VEGF predicts response to platinum based chemotherapy in patients with epithelial ovarian cancer［J］.Angiogenesis，2011，14(2):155

［6］曲芃芃，石峥，李娜，等.卵巢上皮性癌细胞中E 钙黏素基因的甲基化状态及去甲基化的意义［J］.中华妇产科杂志，2009，44(7):538

［7］Kawasaki S，Yagi H，Yamasaki K，et al.A novel mutation of the TGFBI gene causing a lattice corneal dystrophy with deep stromal involvement［J］.Br J Ophthalmol，2011，95(1):150

［8］Kang S，Dong SM，Park NH.Frequent promoter hypermethylation of TGFBI in epithelial ovarian cancer［J］.Gynecol Oncol，2010，118(1):58

［9］Khodyrev DS，Loginov VI，Pronina IV，et al.Methylation of promoter region of RAR-beta2 gene in renal cell，breast and ovarian carcinomas［J］.Genetika，2008，44(8):1126

［10］高冬玲，郝志芳，殷智榕，等.卵巢上皮性肿瘤组织中微血管密度与VEGF 的表达［J］.郑州大学学报:医学版，2002，37(2):179