王煜霞，宋晓荣，姬明丽 ，王建刚，郭 勇，刘自国

1)新乡医学院病理生理学教研室 新乡453003 2)新乡医学院机能学实验室 新乡453003 3)新乡医学院 新乡453003

#通讯作者，女，1975年7月生，硕士，副教授，研究方向:肺损伤机制及干预，E-mail:lmjsy@sina.com

部分左心心肌梗死的患者溶栓治疗后，病情非但没有缓解，反而导致呼吸功能障碍，因此探讨左心缺血再灌注后急性肺损伤的机制可为临床治疗左心功能不全所致的急性呼吸衰竭提供理论基础和实验室依据。作者从左心缺血再灌注诱导的急性肺损伤大鼠模型入手，探讨黏附分子-1 (inflammatory cell adhesion molecule-1，ICAM-1)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)在左心缺血再灌注诱导的急性肺损伤中的作用及对呼吸功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 60 只SD 大鼠购自河南省实验动物中心，雌雄不限，体质量250～350 g，采用随机数字表法分为实验组和对照组，每组30 只。

1.2 主要仪器及试剂 BL-420 生物信号采集分析系统购于泰盟生物仪器有限公司; TNF-α 酶联检测试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司; TNFα 和ICAM-I SP-0023 免疫组化试剂盒购于北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 动物造模、检测项目及方法 2组在进行胸部手术操作之前均在剑突下面作一小切口，暴露膈肌，将2 个针式电极挂于膈肌两侧，电极与BL-420 生物信号采集分析系统连接，记录呼吸曲线。左心室缺血再灌注肺损伤模型的制作参考文献［1］进行。实验组大鼠全麻后开胸，结扎左冠状动脉的前降支，30 min 后，剪开结扎线，恢复血供，造成缺血后再灌注损伤。对照组只穿线，不结扎此血管。

选择缺血30 min(T1)、再灌注30 min(T2)、再灌注60 min(T3)3 个时间点，每个时间点各取10 只大鼠，在记录呼吸曲线后均经颈外静脉取外周血5 mL，之后处死动物，取肺，行支气管肺泡灌洗，取支气管肺泡灌洗液(bronchial alveolar lavage fluid，BALF)5 mL; 采用酶联免疫法分别检测外周血和BALF 中TNF-α 的水平。

取肺右下叶，以40 g/L 多聚甲醛固定，石蜡包埋、5 μm 厚切片，HE 染色，光镜下观察各时间点2组大鼠肺组织病理形态学的变化，免疫组化SP 法检测各时间点2组大鼠肺组织TNF-α、ICAM-1 的表达。TNF-α 免疫反应阳性物质表达在细胞胞质，呈棕黄色至深棕黄色颗粒。ICAM-1 免疫反应阳性表达产物为棕黄色颗粒，分布于细胞膜或细胞质内。参考文献［2］采用半定量法判定结果:选10 个高倍视野，每个视野计数100 个细胞，无明显阳性细胞为“－”，阳性细胞百分比＜25% 为“+”，25%～为“”，＞75%为“”。

1.4 统计学处理 采用SPSS 11.0 处理数据，2组呼吸曲线参数的比较、BALF 和外周血中TNF-α 水平的比较采用2×2 析因设计的方差分析;2组大鼠各时间点肺组织ICAM-1、TNF-α 蛋白表达情况的比较采用秩和检验; 实验组大鼠肺组织中ICAM-1 与TNF-α 蛋白表达的相关性采用spearman 秩相关分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 2组大鼠肺组织病理形态学观察 实验组双肺可见散在的淤血点，偶见融合的大面积淤血斑，以肺底部和背侧面多见，轻挤切面有淡红色泡沫样液体溢出，T1 时肺间隔内可见中性粒细胞、毛细血管扩张;T2 时可见肺泡间隔增厚，间隔内中性粒细胞浸润;T3 时可见弥漫性肺间隔增厚、浸润明显，有水肿液，呈急性炎症反应的表现。对照组双肺偶见淤血点，切面无泡沫样液体溢出，未见中性粒细胞，肺泡间隔正常，无急性炎症反应的表现。

2.2 2组大鼠呼吸曲线比较 3 个时间点实验组大鼠呼吸曲线的幅度、强度和持续时间均低于对照组，差异有统计学意义。见表1。

表1 2组大鼠呼吸曲线的比较(n=10)

2.3 2组大鼠外周血和BALF 中TNF-α 水平的比较 见表2。

2.4 2组大鼠肺组织中ICAM-1、TNF-α 蛋白的表达 见图1(仅选择T2 时2组大鼠肺组织ICAM-1、TNF-α 蛋白的表达情况)，表3、4。T1、T2、T3 时，实验组大鼠肺组织ICAM-1 蛋白的表达与TNF-α 蛋白的表达均呈正相关，T1 时rS=0.362，P =0.001;T2时rS= 0.741，P = 0.001; T3 时rS= 0.803，P =0.026，见表5。

表2 2组大鼠外周血和BALF 中TNF-α 水平比较(n=10)ng/L

图1 T2 时2组大鼠肺组织ICAM-1(A)和TNF-α(B)蛋白的表达(SP，×400)

表3 2组大鼠肺组织ICAM-1 表达的比较

表4 2组大鼠肺组织TNF-α 表达的比较

表5 实验组大鼠肺组织中CAM-1 与TNF-α 蛋白表达的关系(n=10)

3 讨论

该研究采用左心缺血再灌注诱导大鼠急性肺损伤，结果显示与对照组相比，实验组肺组织病理形态学改变呈急性炎症反应的表现，且实验组大鼠呼吸曲线的幅度、强度、持续时间均低于对照组，提示实验组大鼠肺组织发生炎性反应，引起呼吸功能减退，出现急性肺损伤。

中性粒细胞黏附于血管内皮细胞是炎性损伤过程的第一步，也是炎性损伤发生发展过程中的关键。ICAM-1 是一种主要表达于内皮细胞表面的跨膜糖蛋白，生理状态下在大多数组织内不表达或低表达［3-4］。当病理性因素导致内皮细胞表达ICAM-1上调时，上调的ICAM-1 与活化的中性粒细胞表面的整合素相互作用，而致中性粒细胞的变形性降低［5］，与血管内皮细胞的黏附力大大增加，并向血管的特定部位迁移，从而发生白细胞黏附聚集，是介导中性粒细胞参与炎症损伤级联扩大反应的基础。TNF-α 是一种重要的前炎性细胞因子，可诱导多种化学趋化素和黏附因子的表达［6-8］。有实验［9］证明中性粒细胞与TNF-α 作用后的肺微血管内皮细胞通过ICAM-1 黏附，诱导微血管内皮细胞产生氧自由基，中性粒细胞跨内皮迁移及水肿形成。该研究结果显示左心缺血再灌注诱导的肺损伤大鼠外周血和BALF 中TNF-α 水平增高，且肺组织ICAM-1 蛋白表达上调，证实了TNF-α 水平上调促使肺微血管内皮细胞表达ICAM-1 增多。

此外，该研究结果还显示实验组大鼠肺组织ICAM-1 和TNF-α 蛋白表达均上调，二者的表达呈正相关，结合作者前期研究［10-11］结果:TNF-α 的表达上调会使肺部炎性细胞因子IL-8、IL-1β 等的表达上调，使炎症反应失衡，可进一步扩大炎性损伤，推测左心缺血再灌注后肺循环中TNF-α 增加，肺组织ICAM-1表达上调，细胞因子释放增加，扩大炎症反应，炎症级联反应失衡，引起炎症损伤，导致呼吸功能减退。

综上所述，左心缺血再灌注诱导的急性肺损伤机制与TNF-α 诱导内皮细胞表达ICAM-1 上调，启动白细胞的黏附聚集释放反应，扩大炎症级联反应，致炎症反应失衡有关。

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